Trace elements and genomic instability in the murine brain

English. The trace elements copper, iron, manganese, selenium and zinc are essential micronutrients involved in various cellular processes, all with different responsibilities. Based on that importance, their concentrations are tightly regulated in mammalian organisms. The maintenance of those levels is termed trace element homeostasis and mediated by a combination of processes regulating absorption, cellular and systemic transport mechanisms, storage and effector proteins as well as excretion. Due to their chemical properties, some functions of trace elements overlap, as seen in antioxidative defence, for example, comprising an expansive spectrum of antioxidative proteins and molecules. Simultaneously, the same is true for regulatory mechanisms, causing trace elements to influence each other’s homeostases. To mimic physiological conditions, trace elements should therefore not be evaluated separately but considered in parallel. While many of these homeostatic mechanisms are well-studied, for some elements new pathways are still discovered. Additionally, the connections between dietary trace element intake, trace element status and health are not fully unraveled, yet. With current demographic developments, also the influence of ageing as well as of certain pathological conditions is of increasing interest. Here, the TraceAge research unit was initiated, aiming to elucidate the homeostases of and interactions between essential trace elements in healthy and diseased elderly. While human cohort studies can offer insights into trace element profiles, also in vivo model organisms are used to identify underlying molecular mechanisms. This is achieved by a set of feeding studies including mice of various age groups receiving diets of reduced trace element content. To account for cognitive deterioration observed with ageing, neurodegenerative diseases, as well as genetic mutations triggering imbalances in cerebral trace element concentrations, one TraceAge work package focuses on trace elements in the murine brain, specifically the cerebellum. In that context, concentrations of the five essential trace elements of interest, copper, iron, manganese, selenium and zinc, were quantified via inductively coupled plasma-tandem mass spectrometry, revealing differences in priority of trace element homeostases between brain and liver. Upon moderate reduction of dietary trace element supply, cerebellar concentrations of copper and manganese deviated from those in adequately supplied animals. By further reduction of dietary trace element contents, also concentrations of cerebellar iron and selenium were affected, but not as strong as observed in liver tissue. In contrast, zinc concentrations remained stable. Investigation of aged mice revealed cerebellar accumulation of copper and iron, possibly contributing to oxidative stress on account of their redox properties. Oxidative stress affects a multitude of cellular components and processes, among them, next to proteins and lipids, also the DNA. Direct insults impairing its integrity are of relevance here, but also indirect effects, mediated by the machinery ensuring genomic stability and its functionality. The system includes the DNA damage response, comprising detection of endogenous and exogenous DNA lesions, decision on subsequent cell fate and enabling DNA repair, which presents another pillar of genomic stability maintenance. Also in proteins of this machinery, trace elements act as cofactors, shaping the hypothesis of impaired genomic stability maintenance under conditions of disturbed trace element homeostasis. To investigate this hypothesis, a variety of approaches was used, applying OECD guidelines Organisation for Economic Co-operation and Development, adapting existing protocols for use in cerebellum tissue and establishing new methods. In order to assess the impact of age and dietary trace element depletion on selected endpoints estimating genomic instability, DNA damage and DNA repair were investigated. DNA damage analysis, in particular of DNA strand breaks and oxidatively modified DNA bases, revealed stable physiological levels which were neither affected by age nor trace element supply. To examine whether this is a result of increased repair rates, two steps characteristic for base excision repair, namely DNA incision and ligation activity, were studied. DNA glycosylases and DNA ligases were not reduced in their activity by age or trace element depletion, either. Also on the level of gene expression, major proteins involved in genomic stability maintenance were analysed, mirroring results obtained from protein studies. To conclude, the present work describes homeostatic regulation of trace elements in the brain, which, in absence of genetic mutations, is able to retain physiological levels even under conditions of reduced trace element supply to a certain extent. This is reflected by functionality of genomic stability maintenance mechanisms, illuminating the prioritization of the brain as vital organ.

German. Als essentielle Mikronährstoffe spielen die Spurenelemente Kupfer, Eisen, Mangan, Selen und Zink eine wichtige Rolle für eine Vielzahl zellulärer Prozesse. Aufgrund dessen unterliegen ihre Konzentrationen in der Peripherie einer strengen Regulation. Die Aufrechterhaltung dieser Konzentrationen wird als Spurenelementhomöostase bezeichnet und beruht auf der Kombination verschiedener Mechanismen hinsichtlich ihrer Absorption, des zellulären und systemischen Transports, der Regulation von Speicher- und Effektorproteinen sowie ihrer jeweiligen Exkretion. Aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften überschneiden sich einige Funktionen der Spurenelemente. Beispielsweise ist hier die antioxidative Abwehr zu nennen, an welcher eine Vielzahl verschiedener antioxidativer Moleküle und Proteine beteiligt sind. Gleiches gilt für regulative Mechanismen, wodurch Spurenelemente unter Umständen ihre jeweiligen Homöostasen gegenseitig beeinflussen können. Um physiologische Bedingungen abzubilden, sollten Spurenelemente somit nicht isoliert betrachtet, sondern gemeinsam untersucht werden. Obwohl viele homöostatische Mechanismen bereits gut erforscht sind, werden für einige Elemente immer noch neue Stoffwechselwege identifiziert. Darüber hinaus sind auch die Zusammenhänge zwischen der Spurenelementaufnahme aus der Nahrung sowie dem Spurenelement- und Gesundheitsstatus noch nicht vollständig aufgeklärt. Im Zuge der aktuellen demografischen Entwicklung steigt zudem das Interesse daran, den Einfluss des Alterungsprozesses sowie bestimmter Erkrankungen zu untersuchen. In diesem Kontext wurde die Forschungsgruppe TraceAge gegründet, welche dazu beitragen soll, zum einen die homöostatische Regulation und zum anderen die Interaktionen essentieller Spurenelemente in gesunden und erkrankten älteren Menschen zu untersuchen. Hierbei werden einerseits humane Kohortenstudien beprobt, so dass Spurenelementprofile erstellt werden können. Darüber hinaus werden auch in vivo Modellorganismen verwendet, um zugrundeliegende molekulare Mechanismen zu erfassen. In murinen Fütterungsstudien erhielten Tiere unterschiedlicher Altersgruppen deshalb eine spurenelementreduzierte Diät. Um kognitive Beeinträchtigungen zu beachten, wie sie neben dem Altern auch bei neurodegenerativen Erkrankungen sowie bestimmten genetischen Mutationen, meist im Zusammenhang mit Spurenelementdishomöostasen, auftreten, konzentriert sich ein Projektbereich auf die Wechselwirkung von Spurenelementen im murinen Gehirn, wobei hier der Fokus auf das Cerebellum gelegt wurde. In diesem Zusammenhang wurden die Konzentrationen fünf essentieller Spurenelemente, Kupfer, Eisen, Mangan, Selen und Zink, mittels Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma in den Organen der Tiere quantifiziert, wodurch sich Unterschiede in der Priorität der Aufrechterhaltung von Spurenelementhomöostasen zwischen Gehirn und Leber aufzeigten. Eine moderate Verringerung der Spurenelementgehalte in der gefütterten Diät wirkte sich dabei besonders auf die Konzentrationen von cerebellärem Kupfer und Mangan aus. Bei weiterer Spurenelementreduktion sanken auch die Konzentrationen von cerebellärem Eisen und Selen. Im Vergleich zur Leber waren diese Abnahmen jedoch weniger ausgeprägt. Im Gegensatz dazu blieben die Zinkkonzentrationen in Leber und Gehirn unverändert. Untersuchungen in älteren Mäusen zeigten eine Akkumulation von Kupfer und Eisen im Cerebellum. Möglicherweise trägt dies durch deren Redoxeigenschaften zur Entstehung von oxidativem Stress bei. Oxidativer Stress wirkt sich auf eine Vielzahl zellulärer Bestandteile, wie Proteine und Lipide, aber auch auf die DNA, sowie auf den Ablauf von Zellvorgängen aus. Dabei sind einerseits direkte Einflüsse auf die strukturelle Integrität der DNA von Relevanz, andererseits auch indirekte Effekte, welche durch Mechanismen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität vermittelt werden. Dieses System beinhaltet die DNA-Schadensantwort, welche die Identifikation von DNA-Schäden und die Entscheidung über das weitere Schicksal der Zelle beinhaltet. Darüber hinaus ist diese für die Initiation der DNA-Reparatur verantwortlich, welche einen weiteren zentralen Mechanismus zur Instandhaltung genomischer Stabilität darstellt. Auch die Proteine der DNA-Reparaturwege nutzen Spurenelemente als Kofaktoren, worin die Hypothese zur Beeinträchtigung der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität unter Bedingungen einer inadäquaten Spurenelementversorgung begründet wird. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden in der vorliegenden Arbeit diverse Methoden unter Anwendung von OECD-Richtlinien, der Anpassung existierender Versuchsvorschriften an die spezifischen Anforderungen von Cerebellumgewebe, sowie die Entwicklung neuer Methoden angewandt. Zur Einschätzung des Einflusses von Alter und Spurenelementversorgung aus der Diät auf verschiedene Endpunkte der genomischen Instabilität wurden insbesondere die DNA-Schädigungen und die DNA-Reparatur als molekulare Zielstrukturen analysiert. DNA-Schäden, primär DNA-Strangbrüche und oxidativ modifizierte DNA-Basen, wiesen dabei stabile, physiologische Level auf, die nicht durch Alter oder Spurenelementzufuhr verändert wurden. Um festzustellen, ob dies ein Resultat erhöhter Reparaturvorgänge ist, wurden zwei charakteristische Schritte der Basenexzisionsreparatur, DNA-Inzision und DNA-Ligation, näher untersucht. Es zeigte sich jedoch kein Einfluss auf die DNA-Reparatur einleitenden DNA-Glykosylasen sowie auf die DNA-Reparatur abschließenden DNA-Ligasen. Auch auf Genexpressionsebene wurden wichtige Gene der Proteine der genomischen Stabilität analysiert, welche die Ergebnisse proteinbezogener Studien widerspiegelten. Abschließend lässt sich somit feststellen, dass die Spurenelementhomöostase des Gehirns, selbst unter Bedingungen der defizienten Spurenelementzufuhr, streng reguliert ist. Dadurch können physiologische Spurenelementkonzentrationen bis zu einem gewissen Grad konstant gehalten werden. Dies spiegelt sich auch in der Funktionalität von Mechanismen zur Erhaltung genomischer Stabilität wider, welche die Priorität des Gehirns im Organismus unterstreicht.