Langzeituntersuchung zum Vorkommen und zur Transmission von ESBL/AmpCproduzierenden Escherichia coli in Hähnchenmastbetrieben | Long-term study on the prevalence and transmission of ESBL/AmpC-producing Escherichia coli in broiler fattening farms

Antibiotikaresistenzen stellen weltweit sowohl in der Human- als auch der Veterinärmedizin ein ständig größer werdendes Problem dar. Bei der Resistenzentwicklung von Enterobacteriaceae gegen Beta-Laktam Antibiotika spielen die Plasmid-vermittelten Beta-Laktamasen eine entscheidende Rolle. Die Produktion von Beta-Laktamasen als Beta-Laktam-Ring spaltende Hydrolasen und die damit verbundene enzymatische Inaktivierung von Beta-Laktam-Antibiotika ist einer der am weitesten verbreiteten Resistenzmechanismen bei Bakterien. Durch die sogenannten Extended-Spectrum-Beta-Laktamasen (ESBL) wird die Effektivität von modernen extended-spectrum Cephalosporinen und Monobactamen dramatisch reduziert. Seit Jahren werden weltweit steigende Nachweise von ESBLs beschrieben. Studien berichten von ESBL-produzierenden E. coli und auch anderen Enterobakterien in gesunden Lebensmittel liefernden Tieren in Europa, unter anderem auch bei gesunden Masthähnchen. Aber auch in Endprodukten und Lebensmitteln wie Fleisch, Fisch und Rohmilch können die resistenten Bakterien nachgewiesen werden. Aufgrund der zum Vorkommen und zur Verbreitung von „ESBLs/AmpCs“ bei Mensch, Tier und Lebensmitteln, in Deutschland dürftigen Datenlage, wurde das Verbundprojekt RESET, finanziert aus Mitteln des Bundesministerium für Bildung und Forschung, ins Leben gerufen. Hier wurden (und werden in einer zweiten Förderphase) von Forschergruppen aus Tier- und Humanmedizin umfangreiche Erhebungen durchgeführt. Als Teilaspekt des RESET Verbundes war das übergeordnete Ziel der hier vorgelegten Arbeit, die Untersuchung der Nachweishäufigkeit von ESBL/AmpC - produzierenden E. coli in konventionellen deutschen Masthähnchenbetrieben während des gesamten Mastverlaufes. Vor allem sollten neue Erkenntnisse über die Besiedlungsdynamik der resistenten Bakterien sowie deren Verbreitung im Masthähnchenstall gewonnen werden. Zusätzlich lag der Fokus auf der Untersuchung verschiedenster Transmissionswege ESBL/AmpC-produzierender Enterobakterien, speziell E. coli, aus den Masthähnchenhaltungen heraus in die Umwelt oder umgekehrt. In initialen Untersuchungen wurden 16 Masthähnchenbetriebe auf ihren ESBL/AmpC- Status hin mittels Sockentupferproben, untersucht. Aus diesen 16 Betrieben wurden sieben ESBL/AmpC - positive Masthähnchenhaltungen in die hier beschriebenen Langzeituntersuchungen zur Prävalenz und Transmission der resistenten Mikroorganismen aufgenommen. Zur Ermittlung der Nachweishäufigkeiten von ESBL/AmpC-produzierenden E. coli in den Masthähnchenhaltungen während des Mastverlaufes wurden in jedem Betrieb dreimalig (Beginn, Mitte und Ende der Mast) umfangreiche Messungen und Probenahmen am Tier, der Tierumgebung, der Stallluft und Stallabluft sowie der Stallumgebung durchgeführt. Um die verschiedenen potentiellen Emissionswege ESBL/AmpC-produzierender Enterobakterien, speziell E. coli, aus den Tierhaltungen in die Umwelt hinaus aufzudecken, wurden unter anderem ESBL- produzierende E. coli speziell in der Stallluft sowie in der Stallabluft mittels Impingement bestimmt. Sowohl die Luftproben außerhalb der Masthähnchenställe als auch Proben von Bodenflächen der direkten Stallumgebung wurden dabei, in Abhängigkeit der jeweiligen Windrichtung zum Stallgebäude, entnommen. Zusätzlich konnten Gülleproben direkt aus der Güllelagune entnommen und auf ESBL/AmpC-E. coli untersucht werden. Alle aus diesen Proben mittels Kultivierung auf antibiotikahaltigen Selektivmedien gewonnenen phänotypisch ESBL-verdächtigen Isolate wurden mittels MALDI-TOF als E. coli bestätigt und anschießend mittels PCR als Träger eines ESBL - Gens oder plasmidkodierten AmpC - Gens bestätigt. Darüber hinaus wurden ausgewählte Isolate der Stallumgebung und des Tierstalles mittels Pulsed-Field-Gelelektrophorese (PFGE) auf ihren klonalen Zusammenhang hin untersucht. Als erstes Ergebnis ist hervorzuheben, dass in jedem der untersuchten Ställe zu jedem Untersuchungszeitpunkt in mindestens einer Probe ESBL/AmpC-produzierende E. coli nachgewiesen und deren Resistenzgene mittels PCR identifiziert werden konnten. Dabei konnten die resistenten Mikroorganismen regelmäßig sowohl im Stall, z.B. im Staub oder der Einstreu, als auch auf dem Boden der Stallumgebung und der Gülle, aber auch in der Stallluft sowie Stallabluft nachgewiesen werden. Die Nachweishäufigkeiten bei den Tieren aus jeweils zwanzig Einzeltiertupferproben pro Bestand variierten für ESBL/AmpC - produzierende E. coli zwischen 0% und 100%. Damit erbringen die Ergebnisse dieser Arbeit den Nachweis, dass ESBL/AmpC - produzierende E. coli in Kloakentupfern klinisch gesunder Masthähnchen sowie in deren Stallumgebung regelmäßig vorkommen. Dabei konnten bereits in Eintagsküken hohe Prävalenzen der resistenten Mikroorganismen nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmals ein signifikanter Anstieg der Nachweishäufigkeit der resistenten Bakterien im Verlauf der Mastperiode nachgewiesen. Dieser Prävalenzanstieg konnte sowohl in den Einzeltierproben als auch in den Proben der Tierumgebung innerhalb der Mastperiode gezeigt werden. Zudem kann in der vorliegenden Arbeit neben dem möglichen Eintrag der ESBLs/AmpCs über positive Eintagsküken auch ein Einfluss der Tierumgebung auf den ESBL/AmpC - Status der Masthähnchenherde aufgezeigt und belegt werden. Als weiteres Hauptergebnis konnte mit dieser Arbeit die Hypothese des fäkalen sowie aerogenen Austrags von ESBL/AmpC - produzierenden E. coli aus Masthähnchenhaltungen in die Umwelt untermauert werden. Mit Hilfe der PFGE wurden klonale Übereinstimmungen verschiedener Isolate von innen und außen nachgewiesen. So zeigten sich nach Auswertung der Restriktionsprofile 86,3 %ige bis 100 %ige klonale Übereinstimmungen bei Isolaten aus dem Tierstall (Luft und Gülle) verglichen mit denen aus der Stallumgebung. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass sowohl die fäkale als auch die aerogene Emission ESBL/AmpCproduzierender E. coli aus Masthähnchenbetrieben, unter anderem durch das Aufbringen kontaminierter Gülle sowie durch Stallabluft, sehr wahrscheinlich ist. Zugleich kann durch diese Ergebnisse auch ein potentieller Eintrag der resistenten Mikroorganismen über die Luft oder andere Vektoren nicht ausgeschlossen werden.

Resistances against antibiotics represent a growing challenge for both human and veterinary medicine around the globe. Plasmid-transmitted beta lactamases play a pivotal role in the development of resistances against beta-lactam antibiotics in Enterobacteriaceae. The bacterial synthesis of hydrolases with the capability of cleaving the beta lactam ring and thereby enzymatically inactivating beta lactam antibiotics is one of the most common bacterial antibiotic resistance mechanisms. In this context, a subgroup of beta lactameses termed 'extended spectrum beta lactamases' (ESBL) are of particular relevance, as they are capable of dramatically reducing the efficacy even of modern extended-spectrum cephalosporine und monobactame antibiotics. In recent years, increasing evidence of ESBLs have been described worldwide. Studies have reported of ESBL - producing E. coli, and other enterobacteriaceae; in healthy livestock in Europe .inter alia, in healthy broilers. In addition, resistant bacteria have been found in end products and foods such as meat, fish and raw milk. Due to the limited data available on the presence and potential distribution of 'ESBLs/AmpCs' in humans, animals and foods in Germany, the collaborative project RESET was launched, which is financed by assets from the German Ministry of Education and Research (BMBF). In this project, research groups from the fields of veterinary and human medicine have collected and are continuing to collect (during a second promotion period) substantial amounts of data on the dissemination of ESBLs in the food chain. As one aspect of the RESET collaboration, the main focus of the work presented here was the analysis of the detection frequency of ESBL/AmpC - producing E. coli in conventional broiler fattening farms in Germany throughout the entire fattening period. In particular, it was the aim to achieve new insights into the colonization dynamic of the resistant bacteria as well as their distribution in the broiler fattening farm houses. An additional focus was the analysis of a variety of transmission pathways of ESBL/AmpC- producing Enterobacteriaceae, particularly E. coli, from broiler fattening farms to the surrounding environment or vice versa. In initial investigations, the ESBL/AmpC - status of 16 broiler fattening farms was determined using boot swab samples. Of these 16 farms, seven ESBL/AmpC - positive broiler fattening farms were included in the long-term study on the prevalence and transmission of resistant microorganisms which is presented here. To determine the detection frequencies of ESBL/AmpC - producing E. coli in broiler fattening farms during the course of the fattening period, extensive measurements and sample collections from animals, their surroundings, the stable air and exhaust as well as the stable surroundings were carried out in each of the examined broiler fattening farms on three occasions during the fattening period (beginning, middle and end). Moreover, impingement was used to determine the presence of ESBLproducing E. coli and other microorganisms in the stable air and exhaust in order to identify potential emission pathways of ESBL/AmpC-producing Enterobacteriaceae, particularly E. coli, from animal farms into the environment. In doing so, the air samples from outside animal housings as well as the floor samples from the direct stable surroundings were collected in dependence of the respective wind direction. In addition, slurry samples were collected directly from the slurry pit and examined for ESBL/AmpC - E. coli. All suspected ESBL/AmpC- producing colonies isolated from MacConkey agar, containing antibiotics, gathered from these samples were identified as E. coli using MALDI-TOF and subsequently confirmed as carriers of an ESBL gene or plasmid-coded AmpC gene using PCR. In addition, selected isolates from the stable surroundings and the stable were analyzed for clonal relation using pulsed field gel electrophoresis (PFGE). As a first result it should be emphasized that, at every sampling occasion, there was at least one sample from each broiler fattening farm where ESBL/AmpC-producing E. coli were identified and their resistance genes could be identified using PCR. Moreover, the resistant microorganisms were regularly found in the stable air, e.g. in dust or litter, as well as on the floor of the stable surroundings, the slurry and the stable air and exhaust. The detection frequencies of ESBL/AmpC- producing E. coli in animals, from each 20 swab samples from individual animals per farm varied between 0% and 100%. Nevertheless, the results of our work show that ESBL/AmpC-producing E. coli are regularly present in cloacal swabs of clinically healthy broilers as well as their stable surroundings. In addition, high prevalences of the resistant microorganisms could even be found in day-old chicks. Moreover, our results are the first report of a significant increase of the detection frequency of resistant bacteria during the course of the fattening period. This increase in prevalence was shown during the whole fattening period in samples from individual animals as well as in samples from the animal's surroundings. Therefore, apart from the possible entry via positive day-old chicks, the current results demonstrate an influence of the stable environment on the ESBL/AmpC status of a broiler flock. As a further main result, these work strengthen the hypothesis of fecal and aerogenic dissemination from broiler farms into the environment, as PFGE analyses showed clonal matching between different isolates from inside and outside the animal housings. PFGE shows results of restriction profile analyses with 86.3% to 100% clonal matching of isolates from the stables (air and slurry) in comparison to isolates from the stable surroundings. Based on these results, it can be concluded that fecal and aerogenic emission of ESBL/AmpCproducing E. coli from broiler fattening farms through, among others, distribution of contaminated slurry and stable exhaust is highly probable. However, the results of this work do not exclude that there may also be an influx of the resistant microorganisms.