Development of a broth microdilution method for biocide susceptibility testing of bacteria | Entwicklung einer Bouillon-Mikrodilutionsmethode für die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien

Entwicklung einer Bouillon-Mikrodilutionsmethode für die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung von Bakterien: Biozide sind für die Kontrolle bakterieller Krankheitserreger in vielen Bereichen wichtig. Es gibt zahlreiche Berichte über biozidresistente Bakterien und zudem können Biozide auch zur Entwicklung und Verbreitung von bakteriellen Krankheitserregern beitragen, die gleichzeitig gegen Biozide und antimikrobielle Wirkstoffe kreuzresistent sind. Es besteht daher die dringende Notwendigkeit, die Entstehung und das Ausmaß von Biozidresistenzen zu überwachen. Dafür sind standardisierte Methoden erforderlich, die reproduzierbare und vergleichbare Informationen liefern. Eine dazu geeignete Methode muss ein Hochdurchsatz-Screening ermöglichen, einfach anzuwenden sein und gleichzeitig sehr präzise Ergebnisse liefern. Hierbei ist nicht nur die Testmethode selbst zu berücksichtigen, sondern auch ein Verfahren zur Überprüfung der korrekten Inokulumdichte, die einen wichtigen Testparameter darstellt. Das Ziel dieser Studie war es, eine Bouillon-Mikrodilutionsmethode für die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung zu entwickeln und zu untersuchen, ob die Bestimmung der Inokulumdichte während der Biozid-Empfindlichkeitsprüfung vereinfacht werden kann, ohne die Qualität der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Zur Entwicklung der Bouillon-Mikrodilutionsmethode wurden mehrere Parameter untersucht, um die minimalen Hemmkonzentrationen (MHKs) für Benzalkoniumchlorid, Chlorhexidin, Glutardialdehyd (2-fache Verdünnungsreihe) und Isopropanol (2 %-Schritte) mittels Bouillon-Mikrodilution in sieben unabhängigen Tests zu bestimmen. Die Referenzstämme Staphylococcus aureus ATCC® 6538, Enterococcus hirae ATCC® 10541, Escherichia coli ATCC® 10536 und Pseudomonas aeruginosa ATCC® 15442 wurden mit Trypton-Soja-Bouillon als Testmedium untersucht. Die Mikrotiterplatten enthielten ein Endvolumen von 200 µL/Vertiefung. Es wurden vergleichende Studien durchgeführt, da bestehende Methoden für Biozid-Wirksamkeitstests und antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfungen unterschiedliche Parameter verwenden. Um eine geeignete Bouillon-Mikrodilutionsmethode für die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung zu entwickeln, wurde der Einfluss dieser verschiedenen Parameter eingehend untersucht. Die vergleichenden Untersuchungen umfassten die folgenden Parameter: (i) die Verwendung unterschiedlicher Subkulturen (1. oder 2. Subkultur, SK), (ii) unterschiedliche Arten der Inokulumsuspension (direkte Kolonie-Suspensionsmethode mit oder ohne Verwendung von Glasperlen), (iii) unterschiedliche Inokulumdichten, entweder gemäß DVG (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e.V.) oder gemäß CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) und (iv) Ablesen der Ergebnisse nach aerober Bebrütung bei 37 °C und drei verschiedenen Inkubationszeiten (24 h, 48 h und 72 h). Für jede Stamm-Biozid-Kombination wurden 168 MHK-Werte bestimmt. Insgesamt lagen die meisten Ergebnisse innerhalb ± einer Verdünnungsstufe vom am häufigsten gemessenen Wert, was als akzeptabler Bereich definiert wurde. Die Ergebnisse der vergleichenden Untersuchungen wurden auf ihre Stabilität hin bewertet, indem die Abweichungen vom akzeptablen Bereich berechnet wurden. Basierend auf den Ergebnissen wird folgendes Protokoll vorgeschlagen: Verwendung einer frischen Übernacht-Kultur (1. oder 2. SK), Herstellung der Inokulumsuspension über die direkte Kolonie-Suspensionsmethode mit oder ohne Glasperlen, Inokulumdichte gemäß DVG oder CLSI und Inkubation bei 37 °C für 24 h. Methoden zur Bestimmung der Inokulumdichte beziehen sich üblicherweise auf Zellzahlen und wurden für die Biozid-Wirksamkeitsprüfung durch die DVG und für die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung durch das CLSI beschrieben. Um die beiden Methoden zur Zellzahlbestimmung vergleichend zu untersuchen, wurde jeder der vier Referenzstämme 28-mal mit der Inokulumpräparation nach DVG und CLSI vergleichend getestet. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Bland-Altman-Plots und 95 %-Übereinstimmungsgrenzen statistisch ausgewertet und die Zellzahlen mit der optischen Dichte der verwendeten Bakteriensuspensionen korreliert. Die beobachteten Abweichungen zwischen den beiden Methoden lagen innerhalb eines log10-Schrittes und die gemessene Anzahl der koloniebildenden Einheiten unterschied sich nicht systematisch. Daher erwiesen sich beide Methoden als geeignet für die Zellzahlbestimmung. Die CLSI-Methode ist zu empfehlen, da sie weniger Verdünnungsschritte erfordert. Die vorgeschlagene Bouillon-Mikrodilutionsmethode für die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung und die vorgeschlagene Methode für die Bestimmung der Zellzahl sind einfach durchzuführen und liefern stabile Ergebnisse, was die Biozid-Empfindlichkeitsprüfung von Bakterienisolaten erleichtern kann und somit einen Schritt in Richtung Harmonisierung darstellt.

Development of a broth microdilution method for biocide susceptibility testing of bacteria: Biocides are important for the control of bacterial pathogens in many settings. There are numerous reports of biocide-resistant bacteria, and biocides may also contribute to the development and spread of bacterial pathogens that are cross-resistant to biocides and antimicrobial agents simultaneously. Hence, there is an urgent need to monitor and observe the emergence and extent of biocide resistance for which standardized methods that provide reproducible and comparable information are necessary. A suitable method shall facilitate high-throughput screening, be easy to use, and at the same time provide highly accurate results. This includes not only the test method itself, but also a method for verifying that the correct inoculum density is maintained, which is an important test parameter. The objective of this study was to develop a broth microdilution protocol for biocide susceptibility testing (BST) and to investigate whether cell counting during BST can be simplified without reducing the quality of the results. To develop the BST protocol, multiple parameters were investigated to determine the minimal inhibitory concentrations (MICs) for benzalkonium chloride, chlorhexidine, glutardialdehyde (2-fold dilution series) and isopropanol (2 %-steps) by broth microdilution using seven independent tests. The reference strains Staphylococcus aureus ATCC® 6538, Enterococcus hirae ATCC® 10541, Escherichia coli ATCC® 10536 and Pseudomonas aeruginosa ATCC® 15442 were used with tryptic soy broth as test medium. The microtitre plates contained a final volume of 200 µL/well. Comparative studies were made because existing methods for biocide efficacy testing and antimicrobial susceptibility testing use different parameters. In order to develop an appropriate BST method, the influence of these different parameters was thoroughly investigated. The comparative investigations included the following parameters: (i) the use of different subcultures (1st or 2nd subculture, SC), (ii) different ways to prepare the inoculum (direct colony suspension method with or without the use of glass beads), (iii) different inoculum densities, either according to DVG (Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e.V., German Veterinary Medical Society) or according to the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), and (iv) reading the results after three different incubation times (24 h, 48 h and 72 h) at 37 °C in ambient air. For each strain/biocide combination, 168 MICs were determined. Overall, most results were within ± one dilution step from the most common value, which was defined as the acceptable range. The results of the comparative investigations were evaluated for their stability by calculating deviations from the acceptable range. Based on these results, the following protocol is proposed: use of a fresh overnight culture (1st or 2nd SC), inoculum suspension via direct colony suspension method with or without glass beads, inoculum preparation according to DVG or CLSI and incubation at 37 °C for 24 h. Methods to determine the inoculum density commonly refer to cell counts and have been described for biocide efficacy testing according to DVG and for antimicrobial susceptibility testing according to CLSI. To comparatively investigate the two methods for cell count determination, each of the four reference strains was comparatively tested 28 times using the inoculum preparation according to DVG and CLSI. The results were statistically analyzed using Bland-Altman plots and 95 % limits of agreement and cell counts were correlated with the optical density of the bacterial suspensions used. The variations observed between the two methods were within one log10 step and the measured number of colony forming units did not differ systematically. Therefore, both methods proved to be suitable for cell count determination. The CLSI method is preferred as it has less dilution steps. The proposed broth microdilution method for BST and the proposed method for cell count determination are easy to perform and provide stable results, which can facilitate BST of bacterial isolates and thus, represent a step towards harmonization.