Charakterisierung eines nicht selektiven Anionenkanals an kultivierten Pansen- und Psalterepithelzellen des Schafes | Characterization of an unselective anion-channel in cultured ovine ruminal and omasal epithelial cells

Der Pansen der Wiederkäuer ist der wichtigste Produktionsort für kurzkettige Fettsäuren (short chain fatty acids, SCFA). Um ein optimales Milieu für die Mikroorganismen im Pansen zu gewährleisten, steht die Produktion der kurzkettigen Fettsäuren in engem Zusammenhang mit deren Resorption aus dem Pansenlumen durch das Pansenepithel (Bergman, 1990; Gäbel et al., 2002). Bei nicht ausreichender Pufferung des Panseninhaltes durch den Speichel verbunden mit unzureichender Adaptation des Pansenepithels kommt es zu einer Entgleisung der Homöostase des Panseninhaltes mit Azidose und ansteigender Osmolarität (Kleen et al., 2003; Krause und Oetzel, 2005). Das Pansenepithel wird geschädigt und Mikroorganismen und Toxine können in den Blutkreislauf gelangen und führen zu gesundheitlichen Schäden, die bis hin zum Tode des Tieres führen können. Die Leistungseinbußen führen zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Der aktuelle Wissenstand über die genauen Transportmechanismen für kurzkettige Fettsäuren am Vormagenepithel der Wiederkäuer ist unvollständig. Da die protonierte Form der kurzkettigen Fettsäuren (HSCFA) lipophil ist, kann diese Form über Diffusion die Zellmembran passieren. Daneben exprimiert das Pansenepithel einen apikalen Cl-/HCO3--Austauscher, dessen physiologische Funktion angesichts der niedrigen Chloridkonzentrationen im Pansenlumen lange Zeit unklar war. Aktuelle Studien zeigen, dass über diese Anionenaustauscher auch kurzkettige Fettsäureanionen (SCFA-) im Austausch gegen HCO3- in die Zelle aufgenommen werden können. Beide Transport-mechanismen führen zu einer Ansäuerung des Zytosols mit Stimulation des apikal lokalisierten NHE (Na+/H+-Austauschers), der Natrium in die Zelle hinein- und Protonen aus der Zelle hinausschleust. Hierdurch wird der intrazelluläre pH-Wert neutral gehalten und Natrium aus dem Pansenlumen resorbiert, welches sowohl für die Reduktion der Osmolarität des Panseninhaltes als auch für die Speichelresekretion bedeutsam ist. Während Butyrat größtenteils intrazellulär verstoffwechselt wird, gelangen insbesondere Azetat und Propionat in großen Mengen über die basolaterale Membran ins Portalblut und dienen so der Versorgung des gesamten Tieres mit Energie. Der basolaterale Ausschleusungsmechanismus für die kurzkettigen Fettsäureanionen ist jedoch bisher unklar. Aktuelle Daten sprechen dafür, dass in Analogie zum apikalen Anionenaustauscher auch die basolaterale Leitfähigkeit für Chlorid wenig selektiv ist und auch Azetat als Substrat akzeptiert (Stumpff et al., 2009). Der Transport von Azetat könnte so in Analogie zum klassischen Chloridtransport über resorbierende Epithelien erfolgen, welches auch am Pansenepithel etabliert ist. Dabei erfolgt die apikale Aufnahme des Anions über einen Anionenaustauscher, während die basolaterale Abgabe über einen Kanal erfolgt (Schmidt et al., 2004). Ein entsprechender großer Anionenkanal mit Permeabilität nicht nur für Chlorid, sondern auch für das Anion des Azetats konnte bereits an isolierten Zellen des Pansenepithels nachgewiesen werden (Stumpff et al., 2009). Im Vergleich zum Pansen liegen über transportphysiologische Funktionen des Psalters nur wenige Erkenntnisse vor. Beobachtungen in vivo und in vitro belegen, dass Na+, Cl-, HCO3- und kurzkettige Fettsäuren transportiert werden. Fortschritte im Verständnis der Transport-mechanismen sind durch das Fehlen eines Zellkulturmodels behindert worden. Ziel der vorliegenden Studie war es, mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik die Leitfähigkeit isolierter Pansen- und Psalterepithelzellen für Propionat sowie für weitere kurzkettige Fettsäuren und Halide zu untersuchen und die Wirkung entsprechender Blocker zu ermitteln. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Studie zusammengestellt: \- Die Etablierung einer neuen Methode zur Isolierung von Psalterepithelzellen. Durch die in dieser Studie neu konzipierte Zellisolationskammer zur Isolierung von Psalterepithelzellen war es zum ersten Mal möglich, Zellen des Psalters in Kultur anzuzüchten und so Patch-Clamp-Experimente an isolierten Psalterepithelzellen durchzuführen. Die Isolierung von Pansenepithelzellen konnte durch diese neue Methode ebenfalls verbessert werden. \- Die immunhistochemische Charakterisierung des Epithels und der daraus isolierten Zellen. Es wurden durch immunhistochemische Färbungen Zytokeratine und die Tight Junction Proteine Occludin, Claudin 1, 4 und 7 am frischen Pansen- und Psalterepithel dargestellt. Diese Proteine konnten auch an isolierten und kultivierten Pansen- und Psalterepithelzellen nachgewiesen werden. Dadurch wurde der epitheliale Ursprung der kultivierten Zellen belegt. \- Der Nachweis eines für große Anionen durchlässigen Kanals an isolierten Pansen- und Psalterepithelzellen. An beiden Präparaten konnte eine Leitfähigkeit für Anionen nachgewiesen werden, die in der Reihenfolge Chlorid > Azetat > Propionat > Butyrat abnahm. Isolierte Pansenepithelzellen wiesen ebenfalls eine gewisse Leitfähigkeit für Laktat auf. Alle Anionenleitfähigkeiten ließen sich durch den Anionenkanalblocker DIDS reversibel hemmen. Die Propionatleitfähigkeit war reversibel pCMBs- und NPPB- sensitiv. Der Blocker des CFTR Glibenclamid hatte keinen Effekt. Die Halidsequenz entsprach mit F- ≈ Cl- ≈ Br- > I- am ehesten einer Eisenmann 1 Sequenz. Die durch Einzelkanalmessungen ermittelte Einzelkanalleitfähigkeit für Pansen- und Psalterepithelzellen beträgt ca. 350 pS für Chlorid, 140 pS für Azetat (Stumpff et al., 2009) und ca. 100 pS für Propionat. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass isolierte Pansen- und Psalterepithelzellen einen großen Anionenkanal mit einer Leitfähigkeit für das kurzkettige Fettsäureanion Propionat exprimieren, welcher auch für andere Anionen in unterschiedlichem Maße permeabel ist. Ein Transportmodell für Fettsäuren über die Vormagenepithelien wird vorgeschlagen mit basolateraler Expression des Kanals. Die auf diesem Wege resorbierten Fettsäureanionen werden von dem von der Na+-K+-ATPase herrührenden Potential ins Blut getrieben. Die zugehörigen Protonen verbleiben im Pansenlumen und müssen dort durch den Speichel abgepuffert oder auf anderem Wege aus dem Pansen entfernt werden. Beim Versagen dieser Mechanismen kommt es zur Pansenazidose.

The rumen is the most important site of short chain fatty acid (SCFA) production in cows and sheep and absorption must increase in synchrony with production to ensure an optimal environment for ruminal microbes. Insufficient salivary buffering of the ruminal content in conjunction with inadequate adaptation of the epithelium leads to a breakdown of ruminal homeostasis with acidosis and rising osmolarity (Kleen et al., 2003; Krause und Oetzel, 2005). Ruminal microbes and toxins can pass through the damaged epithelium into the blood system of the animal causing severe illness that may be fatal (Krause 2005, Owens 1998). The concomitant decrease in animal productivity leads to large economic losses. However, our current understanding of the mechanisms of transcellular absorption of short chain fatty acids (SCFA) through forestomach epithelia is incomplete. Since the protonated form (HSCFA) is lipophilic, this form can simply diffuse across the lipid bilayer. In addition, the ruminal epithelium expresses an apical Cl-/HCO3--exchanger, the physiological function of which has long been unclear since ruminal chloride concentrations are relatively low. Recent research suggests that this anion exchanger may mediate the cellular uptake of short chain fatty acid anions (SCFA-) in exchange for HCO3-. Both pathways acidify the cytosol and drive the apical uptake of Na+ in exchange for protons via NHE (Na+/H+-exchange). The pH of the cytosolic compartment is thus maintained at neutral values while the absorption of sodium from the ruminal fluid is important both for the reduction of ruminal osmolarity and for the provision of sodium for resecretion with saliva. While butyrate is mostly metabolized intracellularly, large quantities of acetate and propionate cross the basolateral membrane and pass into the portal blood, thus providing energy for the animal as a whole. However, the mechanism for the basolateral extrusion of SCFA has not yet been clarified. A recent study suggests that, as it is the case for the apical anion exchanger, the basolateral conductance for chloride is poorly selective and accepts acetate as a substrate (Stumpff et al., 2009). The transport of acetate could thus follow the classical model of chloride transport across absorbing epithelia, which has also been established for the rumen. In this model, the apical uptake of the anions occurs through an anion exchanger, while the basolateral extrusion occurs via an ion channel (Schmidt et al., 2004). A corresponding large anion channel with permeability not only for chloride, but also for the anions of acetate has recently been characterized in isolated cells of the ruminal epithelium (Stumpff et al., 2009). Compared to the numerous studies on ruminal tissue, only little research has been done to clarify the transport physiology of the omasal epithelium. Observations in vivo and in vitro support the notion that the tissue transports Na+, Cl-, HCO3- and short chain fatty acids. Progress in understanding the underlying transport mechanisms has been hampered by the lack of a suitable cell culture model. The goal of the current study was to use the patch-clamp-technique on isolated ruminal and omasal epithelial cells to investigate the conductance for propionate and for other SCFA and for the halides and to study the effects of corresponding blockers. The following results were obtained: \- The establishment of a new method for the isolation of cells from the omasal epithelium. The development of a new cell isolation chamber allows the isolation and cultivation of cells from the omasum for the first time, allowing patch-clamp-experiments to be performed on isolated cells of the omasum. The isolation of ruminal epithelial cells could also be improved via this method. \- The immunohistochemical characterization of the epithelium and the cells isolated from it. Immunohistochemical staining was used to demonstrate the expression of cytokeratins and of the tight junction proteins occludin, claudin 1, 4 and 7 in fresh ruminal and omasal tissues. These proteins could also be detected in cultured ruminal and omasal cells. The epithelial origin of the cultured cells was thus confirmed. \- The demonstration of a channel permeable to large anions in isolated cells of the rumen and the omasum. In both preparations, a conductance could be demonstrated with permeability decreasing in the order chloride > acetate > propionate > butyrate. Isolated ruminal epithelial cells also showed a certain conductance for lactate. All conductances were sensitive to the anion channel blocker DIDS. The conductance for propionate was reversibly sensitive to pCMBs und NPPB. The blocker of the CFTR channel glibenclamide had no effect. The halide sequence of the channel was F- ≈ Cl- ≈ Br- > I- and thus resembles an Eisenman sequence I. The single channel conductance of the channel was determined in ruminal and omasal cells and corresponds to 350 pS for chloride, 140 pS for acetate (Stumpff et al., 2009) and about 100 pS for propionate. In summary, it could be shown that isolated cells of the rumen and the omasum express a large anion channel with a conductance for the anion of propionate. The channel is also permeable to other anions, albeit to differing degrees. A transport model for SCFA across forestomach epithelia is proposed with a basolateral expression of the channel. The short chain fatty acid anions that are absorbed via this pathway enter the blood driven by the potential generated by the Na+-K+-ATPase. Protons remain in the ruminal lumen and have to be buffered by saliva or removed via alternate mechanisms. When these mechanisms break down, ruminal acidosis follows.