Caracterización molecular, efecto sobre el huésped, y transmisión, del micovirus Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1 (FodV1)

Los micovirus son virus que se encuentran infectando a hongos. Estas infecciones víricas afectan a la mayoría de los grupos taxonómicos de hongos, incluyendo los hongos patógenos de plantas. La característica más señalada de los micovirus es que carecen de una ruta extracelular de infección, y solo se transmiten intracelularmente mediante anastomosis hifal (transmisión horizontal) o durante la esporogénesis (transmisión vertical). Usualmente, las infecciones por micovirus son asintomáticas, pero en algunos casos la infección viral se ha asociado a la alteración de determinados caracteres fenotípicos en sus hongos hospedadores. Particularmente interesantes son los micovirus que inducen hipovirulencia en especies fitopatógenas, es decir, que reducen la virulencia del hongo frente a su planta huésped, debido a la posibilidad de ser utilizados como agentes de control biológico de las enfermedades causadas por sus hongos hospedadores. Todos los micovirus asociados a hipovirulencia tienen genomas de RNA de cadena sencilla (ssRNA) o de cadena doble (dsRNA), e incluyen representantes de las familias Totiviridae, Chrysoviridae, Hypoviridae, Narnaviridae y Reoviridae. En este trabajo se describe la estructura genómica completa, el efecto sobre el fenotipo del aislado hospedador, y la transmisión, del micovirus Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1 (FodV1), un nuevo miembro de la familia Chrysoviridae identificado en el aislado Fod 116 de Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. FodV1 consta de 4 segmentos de dsRNA de 3.555pb (dsRNA1), 2.809 pb (dsRNA2), 2.794 pb (dsRNA3), y 2.646 pb (dsRNA4). DsRNA1 y dsRNA3 codifican una ARN polimerasa dependiente de ARN y una proteina de la cápsida, respectivamente; dsRNA2 y dsRNA4 codifican proteínas hipotéticas de función desconocida. El análisis filogenético basado en las secuencias aminoacídicas sitúa a FodV1 en la familia Chrysoviridae, dentro del grupo de los que han sido denominados como “chriso-like” micovirus, todos ellos asociados a la inducción de alteraciones fenotípicas en sus hongos hospedadores. El efecto de FodV1 sobre el fenotipo del hongo se ha determinado utilizando dos versiones del aislado portador Fod 116: una con título elevado del virus (la versión original, Fod 116V+), y otra con niveles residuales de infección viral, obtenida mediante selección y análisis de conidias (Fod 116V-). El análisis comparado de ambas versiones ha puesto de manifiesto un efecto significativo del micovirus FodV1 sobre todos los caracteres fenotípicos analizados. La presencia de títulos altos de FodV1 en el aislado Fod 116 altera la morfología y reduce la velocidad de crecimiento radial en medio sólido, disminuye la tasa de conidiación en medio líquido, y reduce la virulencia sobre clavel del aislado fúngico. Todos estos resultados identifican a FodV1 como un nuevo micovirus inductor de hipovirulencia, con potencial para ser utilizado como agente de control biológico. El éxito en la utilización de micovirus para controlar poblaciones de hongos fitopatógenos depende de la capacidad del micovirus para acumularse de manera estable en su hospedador fúngico, así como de su eficiencia para transmitirse entre aislados y dispersarse en las poblaciones fúngicas naturales. FodV1 presenta un elevado nivel de acumulación en su aislado portador original. Nuestros resultados demuestran que este nivel de acumulación permanece estable a lo largo del tiempo, tras sucesivos subcultivos, o después del paso por planta. Por otra parte, también ha quedado demostrado que FodV1 puede transferirse mediante anastomosis hifal entre aislados vegetativamente compatibles. Para evidenciar dicha transferencia se ha utilizado el aislado originalmente infectado (Fod 116V+, donante) y otro aislado compatible libre de virus y marcado con un gen de resistencia a higromicina (Fod 77HgR, receptor). Los resultados evidencian que el virus no solo se transfiere al aislado receptor, sino que además se acumula en éste a niveles inusualmente altos, similares a los detectados en el aislado donante. El análisis comparado de los aislados Fod 77HgR (libre de virus) y Fod 77HgRV+ (infectado con el virus) ha puesto de manifiesto que FodV1 induce en el nuevo aislado hospedador las mismas alteraciones fenotípicas identificadas en el aislado originalmente infectado. La otra vía de diseminación de la infección viral es a través de las esporas asexuales, o transmisión vertical. En esta tesis se ha analizado la eficiencia en la transmisión vertical de los dos aislados infectados con FodV1, Fod 166V+ y Fod 77HgRV+. Los resultados muestran que dicha eficiencia varía dependiendo del aislado considerado. FodV1 es el primer micovirus asociado a hipovirulencia identificado en la especie F. oxysporum.

Fungal viruses (micoviruses) are viruses that infect fungi. Micoviruses are widespread throughout the major taxonomic groups of fungi, including plant-pathogenic species. They lack extracellular routes of transmission and are transmitted intracellularly by hyphal anastomosis (horizontal transmission) and during sporogenesis (vertical transmission). Frequently, mycovirus infections are cryptic, i.e. no discernible phenotypic effects are observed in their hosts, but in some cases the viral infection has been associated with the alteration of particular phenotypic traits in its fungal host. The most interesting cases are those of mycoviruses that induce hypovirulence in phytopathogenic species, that is, that reduce the virulence of the fungus against its host plant, because the possibility of using them as biological control agents of the diseases caused by their fungal hosts. Mycoviruses that induce hypovirulence have all single-stranded (ss) or double-stranded (ds) RNA genomes, and include representatives of the families Totiviridae, Chrysoviridae, Hypoviridae, Narnaviridae and Reoviridae. In this study we describe the complete genomic structure, the effect on the fungal phenotype, and the transmission, of mycovirus Fusarium oxysporum f. sp. dianthi virus 1 (FodV1), a new member of the family Chrysoviridae identified in isolate Fod 116 of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. FodV1 consists of four dsRNA segments of 3,555 bp (dsRNA1), 2,809 bp (dsRNA2), 2,794 bp (dsRNA3), and 2,646 pb (dsRNA4), respectively. DsRNA1 and dsRNA3 encode a RNA-dependent RNA polymerase and a coat protein, respectively; dsRNA2 and dsRNA4 encode hypothetical proteins with unknown functions. Phylogenetic analysis using aminoacid sequences places FodV1 in the Chrysoviridae family, very close to the designated as “chryso-like” mycoviruses, all of them associated to the alteration of phenotypic traits in their hosts. The effect of FodV1 on the phenotype of the fungus has been analysed using two versions of isolate Fod 116: the original one infected with a very high titer of the virus (Fod 116V+), and another one with a very low titer obtained by single conidia selection (Fod 116V-). Comparative analysis of both versions evidences a significative effect of FodV1 on all the phenotypic traits analyzed. Presence of a high titer of FodV1 in isolate Fod 116 alters the morphology and reduces the radial growth of the colony on solid medium, diminishes the conidiation in liquid medium, and reduces the virulence against carnation of its fungal host. All these results place FodV1 in the group of hypovirulent micoviruses, and open the possibility to its use as a biological control agent of Fusarium wilt of carnation. The successful application of mycoviruses to the control of phytopathogenic fungi depends both on their ability to stably accumulate in the fungal host and on their efficient transmission among isolates in the natural fungal populations. FodV1 reaches a very high level of accumulation in the originally infected isolate. Results obtained in this work show that this high level remains stable over time, after successive subculture or passage through plant. Moreover, it has also been shown that FodV1 can be transferred by hyphal anastomosis among vegetatively compatible isolates. To evidence this, we have used the strain originally infected (Fod 116V+, donor), and another vegetatively compatible virus-free strain that had been previously transformed with a hygromycin resistance gene (Fod 77HygR, recipient). Results obtained show that FodV1 not only transfers to the recipient isolate, but also accumulates at a similar high level in it. Comparative analysis of isolates Fod 77HygR (virus-free) and Fod 77HygRV+ (virus-infected) proves that FodV1 induces in its new host similar phenotypic alterations that those described in the original infected isolate Fod 166V+. Another factor that could contribute to the spread of the mycovirus in the fungal population is the efficiency in the vertical transmission through asexual spores. In this Thesis we have analized the efficiency in the vertical transmission of FodV1 in both virus-infected isolates, Fod 116V+ and Fod 77HygRV+. Results show that this efficiency varies depending on the isolate considered. FodV1 is the first mycovirus associated to hypovirulence identified in the species F. oxysporum.