Development Of An Oxidative Cytomic Panel Of High-Content Miniaturized Assays for Detection of In Vitro Cytotoxicity and Prediction of Acute Toxicity of Drugs and Xenobiotics

Prediction of toxicity of xenobiotics to humans is essential for risk assessment and regulatory Toxicology. Currently, the new European directives urge novel test strategies to be validated for assessing the safety of drugs, chemicals and cosmetics. Ethical and economic considerations, as well as regulatory imperatives to protect both consumers and animals, demand in vitro methods, as validated alternatives to laboratory animals for the detection and prediction of human toxicity, according to the 3Rs principle (Replacement, Reduction and Refinement). In the European Integrated Project “A-Cute-Tox” our laboratory played a leading role to explore new cell systems and new endpoints for in vitro cytotoxicity. In our work with human cell lines, we have found two essential drawbacks in many cell lines extensively used: the presence of mechanisms of drug efflux and the loss of biotransformation activity in liver-derived cells. One limitation of in vitro methods to predict accurately in vivo toxicity is the overexpression in many cells lines of drug resistance mechanisms. The most studied factor of drug resistance is MDR1 gene and its product P-glycoprotein (P-gp), an ATP-dependent extraction pump. P-gp is expressed in normal tissues linked to secretion or barrier functions and in tumors confers the multidrug resistance phenotype. P-gp is overexpressed in renal adenocarcinoma, hepatoma and neuroblastoma (4), tumor types originating the cell lines most used for in vitro studies of nephrotoxicity, hepatotoxicity and neurotoxicity. However, no systematic studies exist on the quantitative influence of efflux pumps on in vitro cytotoxicity data and their extrapolation to human in vivo toxicity. The use of cell lines to predict in vivo toxicity is limited in studies of biotransformation-dependent toxicity. Human primary hepatocytes and immortalized hepatocytes are good but limited alternatives. Primary hepatocytes are scarcely available, have limited growth and lifespan, and undergo early phenotypic alterations. Immortalized hepatocytes loss most of their biotransformation activities. The novel hepatocyte-like cell Hepa-RG (human hepatoma cell line derived from hepatocellular carcinoma) is a promising alternative, since express hepatocyte markers, have various secretory and metabolic functions and drug detoxification activities Usually, in vitro cytotoxicity is estimated as cell death rate, while qualitative studies of intracellular biochemistry are only designed for mechanistic toxicology. Also, most studies involve bulk measurements rather than attempting single-cell based determinations. Flow cytometry and high-content analysis by bioimage (HCA) are based on single-cell multiparametric fluorescence measurements of heterogeneous cell populations while maintaining a typical acquisition rate of hundreds-thousands of cells per second. These novel cytomic functional assays detect early or transient events, being advantageous over assays that quantify simple endpoints, as cell death or general cellular alterations. Oxidative stress, a consequence of excessive production of reactive oxygen species or decreased antioxidant defense, causes cytotoxicity through structural and functional alterations with disruption of cellular homeostasis. To increase the predictivity of acute human toxicity by quantitative in vitro functional assays, we will validate a Cytomic Assay Panel for Oxidative Stress Screening using biotransformation-competent cell lines. The main objective is to improve the predictive value of basal cytotoxicity and biotransformation-dependent cytotoxicity assays as in vitro alternatives to laboratory animals. This will be achieved by investigating the early cellular alterations induced by relevant toxic compounds through a novel toxicity high-content screening strategy (Cytomic Panel of Oxidative Stress Assays) . The specific objectives of the project are: 1. To miniaturize and optimize a panel of cytomic high content assays of oxidative stress based upon automated flow cytometry and HCA by Bioimage in human cell lines that may be amenable to robotization and bioinformatic analysis. 2. To assess the predictive capacity for human acute toxicity of the cytomic assay panel by means of its application to a subset of chemicals whose correlation between in vitro and in vivo toxicities has been previously reported by multicentric studies. 3. To validate the assay panel through the correlation between the cytotoxicity values generated with the assay panel and those obtained in parallel using accepted assays of in vitro cytotoxicity (Neutral Red uptake, MTT, LDH release). 4. To determine the capacity to predict organ specific toxicity of the cytomic assay panel. 5. To determine the ability to correctly classify the compounds using a system for chemical toxicity classification in humans, adapted from the Global Harmonization System (GHS) of the Cytomic Panel of Oxidative Stress panel. 6. To apply this assay panel to quantitative in vitro analysis of basal and biotransformation-dependent cytotoxicity of different reference toxic compounds. 7. To determine the expression of multidrug resistence proteins in the cells.

La predicción de la toxicidad de xenobióticos (cosméticos, productos químicos y medicamentos ) en seres humanos es esencial en la evaluación de riesgos y la Toxicología reguladora. En la actualidad, las nuevas directrices europeas instan a probar estrategias novedosas para evaluar y validar la seguridad de los medicamentos, productos químicos y cosméticos. Consideraciones éticas y económicas exigen métodos in vitro validados como una alternativa al uso de animales para la detección y predicción de toxicidad humana de acuerdo con el principio de las 3Rs (reemplazo, reducción y refinamiento). Para aumentar la capacidad de predicción de la toxicidad aguda en humanos mediante la cuantificación in vitro de ensayos funcionales, nos hemos planteado validar un grupo de ensayos citómicos miniaturizados para la detección de estrés oxidativo en tres líneas celulares de origen humano: hepatoma (HepG2), neuroblastoma (SH-SY5Y) y adenocarcinoma de riñón (A-704). Se han seleccionado 60 compuestos (Tabla 2), que incluyen fármacos y productos químicos, para los cuales se ha documentado la toxicidad aguda in vivo (LD50 o LC50 en sangre), con datos evaluados por el proyecto europeo ACuteTox y depositados en la base de datos Acutoxbase (Sjöström et al., 2008), además de su citotoxicidad basal in vitro, determinada por el ensayo de captación de Rojo Neutro en células 3T3, validado por ICCVAM/ECVAM. Dentro del conjunto de tóxicos seleccionados para nuestro estudio se incluyen, por una parte, compuestos en los que los ensayos de citotoxicidad humana basal predicen la toxicidad humana aguda y compuestos que no se localizan sobre la recta de regresión en la correlación in vitro/in vivo (“outliers”). Las determinaciones de citotoxicidad por CMF incluyen la cuantificación de la actividad peroxidativa, de los niveles intracelulares de anión superóxido y de óxido nítrico y las determinaciones por HCA de los niveles de la base modificada 8-oxo como indicadores de lesión oxidativa al DNA. Posteriormente se utilizó una línea celular con capacidad metabólica (HepaRG) y se comparó los resultados obtenidos con los valores de citotoxicidad basal de HepG2. Finalmente se determinó la presencia de transportadores de fármacos en la membrana plasmática de las cuatro líneas celulares por citometría de flujo y qPCR además de verificar su funcionalidad mediante ensayos de eflujo de sustratos fluorescentes. El objetivo principal del estudio es mejorar el valor predictivo de la citoxicidad basal como alternativa in vitro a los animales de laboratorio, mediante la puesta a punto de procedimientos miniaturizados de cultivo celular y la incorporación de parámetros más específicos, indicadores de dianas moleculares. Esto se abordará mediante la investigación de las alteraciones celulares tempranas inducidas por compuestos tóxicos, aplicando una plataforma de ensayos de toxicidad de alto contenido, el conjunto de ensayos denominados "Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo”. Los objetivos concretos son: 1 – Miniaturizar y optimizar un Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo basado en la citometría de flujo para el análisis in vitro en células humanas susceptible de ser adaptado a la robotización y al análisis bioinformático de los resultados. 2 – Evaluar la capacidad predictiva de toxicidad humana aguda in vivo del Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo mediante su aplicación a una serie de compuestos en los que la correlación entre toxicidad in vivo e in vitro previamente investigada en estudios multicéntricos. 3 – Validar el Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo mediante la correlación de los valores de citotoxicidad obtenidos en los ensayos de estrés oxidativo con los obtenidos en ensayos in vitro de referencia. 4 – Determinar la capacidad del Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo para clasificar correctamente los compuestos usando el sistema GHS adaptado a los datos de humano. 5 – Determinar la capacidad de estos ensayos para predecir la toxicidad órgano-específica. 6 – Aplicar el Panel Citómico de Ensayos de Estrés Oxidativo al análisis cuantitativo in vitro de la citotoxicidad basal y la toxicidad dependiente de biotransformación de diferentes xenobióticos. 7 – Determinar mediante citometría de flujo, PCR cuantitativa y ensayos funcionales la expresión de transportadores multifármaco en las líneas utilizadas.