Characterization of NO synthases from Klebsormidium nitens | Caractérisation des NO synthases de Klebsormidium nitens

English. Nitric oxide (NO) is an important cellular signaling molecule regulating various physiological processes, in both animals and plants. In animals, NO synthesis is mainly catalyzed by NO synthase (NOS) enzymes. In plants, NOS-like activities sensitive to mammalian NOS inhibitors have been measured, although no sequences encoding mammalian NOS have been found in land plants. Interestingly, we identified NOS-like sequences in about twenty algae species. These latter include the filamentous Charophyta green algae Klebsormidium nitens, a biological model to study the early transition step from aquatic algae to land plants. Currently, two NOS were identified in K. nitens genome: i) KnNOS1 which possesses classical mammalian NOS architecture consisting of oxygenase and reductase domains, ii) KnNOS2 displaying a large C-ter extension containing a globin domain.The presence of NOS of great molecular diversity in several algal species while absent from terrestrial plants raises questions about the evolution of this enzyme family in photosynthetic organisms.We initiated the functional characterization of KnNOS by analyzing their primary sequences. From the protein primary sequences, predictive models of the 3D structure of KnNOS were made via AlphaFold and comparison with existing models of mammalian NOS suggested that both KnNOS are functional. Study of the phylogenetic position of KnNOS in comparison to other NOS described in eukaryotes, indicate that both NOS of K. nitens could result from a recent duplication event. The study of their mRNA abundance in response to different abiotic stresses revealed differences suggesting a subfonctionnalisation of these two proteins. In order to study protein partners of KnNOS a pull-down strategy was chosen, requiring the production of recombinant KnNOS1 and KnNOS2. Although the production of KnNOS has not yet been completed, promising results have been obtained in a heterologous yeast system. In parallel, we also built the in silico protein–protein interaction network of human NOS using the BioGRID database and human NOS interaction data. Interestingly, genes encoding orthologs of several of these candidates were found in K. nitens genome. Some of these conserved partners are known to be involved in mammalian NOS regulation and represent interesting candidates for further study.This work has provided new information on the NOS family, notably by characterizing the two NOS isoforms of K. nitens and by highlighting putative differences in their function. Molecular tools developed in this study open the way for a deeper characterization of these proteins and will facilitate future investigations of NO signaling in the green lineage.

French. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule de signalisation cellulaire ubiquitaire. Chez les animaux, la synthèse du NO est principalement catalysée par une famille d’enzyme : les NO synthase (NOS). Chez les plantes, des activités de type NOS sensibles aux inhibiteurs de NOS de mammifères ont été mesurées, bien qu'aucune séquence codant pour des NOS similaires n'y ait été trouvée. De manière intéressante, des séquences NOS-like ont été identifiées chez une vingtaine d’espèces d'algues, et présentent une intéressante diversité structurale en comparaison aux NOS de mammifères. L'algue verte charophyte filamenteuse Klebsormidium nitens, un modèle biologique pour étudier l’adaptation au mode de vie terrestre, a été identifiée au laboratoire comme possédant deux NOS : i) la KnNOS1, qui présente une architecture canonique domaine oxygénase/domaine réductase ii) la KnNOS2, qui possède une structure atypique avec l’adjonction d’un domaine globine dans la partie C-terminale de la protéine.La présence de NOS d’une grande diversité moléculaire au sein de plusieurs espèces d’algue alors qu’elles sont absentes des plantes terrestres questionne sur l’évolution de cette famille d’enzyme chez les organismes photosynthétiques.La caractérisation fonctionnelle des KnNOS a été initiée par l’analyse de leurs séquences primaires nucléotidique et protéique. Depuis les séquences primaires protéiques, des modèles de prédiction de la structure 3D des KnNOS ont été réalisés via AlphaFold et la comparaison avec les modèles existants des NOS de mammifères a suggéré que les deux KnNOS soient fonctionnelles. L’étude de la position phylogénétique des KnNOS en comparaison aux autres NOS décrites chez les eucaryotes indique que les deux NOS de K. nitens pourraient résulter d’un événement de duplication récent. L’étude de l’abondance de leurs ARNm en réponse à différents stress abiotiques a mis en évidence des différences suggérant une sous-fonctionnalisation de ces deux protéines. Afin d’étudier les interactions des KnNOS une stratégie par pull-down a été retenue, nécessitant la production de la protéine recombinante KnNOS1 et KnNOS2. Bien que la production hétérologue des KnNOS n’ait pas encore abouti, des résultats prometteurs ont été obtenus en système hétérologue en levure. En parallèle, nous avons également construit le réseau in silico d'interactions protéine-protéine des NOS humaines en utilisant la base de données BioGRID et les données d'interactions des NOS humaines. Il est intéressant de noter que des gènes codant pour des orthologues de plusieurs de ces candidats ont été trouvés dans le génome de K. nitens. Certains de ces partenaires conservés sont connus pour être impliqués dans la régulation des NOS des mammifères et représentent des candidats intéressants pour une étude plus approfondie.Ce travail de thèse a apporté de nouvelles informations sur la famille des enzymes NOS notamment en caractérisant les deux isoformes de NOS de K. nitens et en mettant en avant des différences dans leur fonctionnement. Les outils moléculaires développés dans ce travail ouvrent la voie vers une caractérisation plus approfondie de ces protéines et va faciliter de futures recherches sur la signalisation NO dans la lignée verte.