Aplicação do método da digestão in vitro para o estudo da patulina (micotoxina) em diferentes fases do processo digestivo

Dissertação de Mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018

Os alimentos podem ser contaminados com compostos químicos como as micotoxinas. Estes metabolitos secundários são produzidos por fungos e podem provocar problemas de saúde graves se não forem monitorizados. A patulina é uma micotoxina com efeitos imunossupressores, genotóxicos, mutagênicos e nefrotóxicos, e está presente principalmente em maçãs e alimentos à base de maçã, incluíndo aqueles que são frequentemente consumidos por crianças, como purés ou sumos de frutas. Uma vez que a via mais frequente de exposição a contaminantes dos alimentos é a ingestão, será importante caracterizar o impacto do processo de digestão sobre a disponibilidade e absorção destes compostos. O presente estudo teve como objetivo determinar a variação de bioacessibilidade (fração de um composto que é libertado a partir da matriz alimentar, no trato gastrointestinal, durante a digestão) da patulina em sumos de fruta à base de maçã (turvos e límpidos) ao longo das diferentes fases do processo digestivo, utilizando para isso o método harmonizado de digestão in vitro. Este método apresenta como principal vantagem, relativamente aos descritos na literatura, o facto de ser harmonizado e de incluir um processo prévio de determinação das atividades das enzimas utilizadas durante a digestão in vitro. Neste estudo foram avaliados os valores médios de bioacessibilidade em 4 amostras de sumo de fruta à base de maçã, nas fases oral, gástrica e intestinal. Para avaliar o impacto do processo de digestão sobre a bioacessibilidade da patulina, utilizaram-se sumos de maçã artificialmente contaminados com esta micotoxina. A identificação e quantificação de patulina nas amostras foram realizadas por cromatografia líquida de alta eficiência com deteção por ultravioleta e extração em fase sólida (SPE- HPLC-UV). Segundo o conhecimento do autor, este é o primeiro estudo que descreve resultados de bioacessibilidade de patulina em sumos à base de maçã, ao longo das três fases do processo de digestão, aplicando o método harmonizado de digestão in vitro. Os resultados de bioacessibilidade de patulina revelaram valores que variaram entre os 56,8% e 94,1% na fase oral, 62,2% e 98,0% na fase gástrica, e 5,4% e 51,2% na fase intestinal. A fase gástrica é a que apresenta valores médios de bioacessibilidade mais elevados (79,3 ± 9,6), próximos dos determinados na fase oral (77,8 ± 11,8%). A fase intestinal apresenta, por outro lado, valores médios de bioacessibilidade mais reduzidos (21,6 ± 16,2%). Não foram verificadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores médios de bioacessibildade das fases oral e gástrica (p value = 0,828). Contudo, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as fases oral e gástrica em relação à fase intestinal (p value < 0,05), sugerindo assim que a maior redução de bioacessibilidade ao longo do processo digestivo da patulina ocorre durante a fase intestinal. p valuep valueA comparação entre diferentes matrizes alimentares, turvas e límpidas, revelaram valores de bioacessibilidade semelhantes nas duas primeiras fases do processo digestivo, ou seja, na fase oral (límpido: 77,2 ± 18,0 %; turvo: 78,4 ± 9,7 %) e gástrica (límpido: 79,9 ± 16,3 %; turvo: 78,6 ± 3,3 %). Já na fase intestinal, os resultados obtidos revelam diferenças entre os sumos de matriz límpida (18,0 ± 4,7%) e os sumos de matriz turva (25,6 ± 26,8). Não se verificam, contudo, diferenças significativas na comparação entre matrizes, considerando cada fase do processo digestivo (p values obtidos nas diferentes fases - Oral: 0,939; Gástrico: 0,821; Intestinal: 1). Face aos resultados obtidos neste estudo que revelaram valores elevados de bioacessibilidade de patulina na fase gástrica, e porque as crianças são consumidoras frequentes de alimentos à base de maçã, considera-se de extrema importância avaliar o risco associado à exposição das crianças a estes produtos. No futuro, sugere-se aumentar o número de estudos de bioacessibilidade de patulina usando o método harmonizado de digestão in vitro, em produtos à base de maçã e outros frutos consumidos por crianças. Deverá ser ainda avaliada a possibilidade de aplicar novos métodos de digestão in vitro que permitam simular a digestão infantil, dado que este processo apresenta diferenças da digestão num adulto.

Food can be contaminated with chemical compounds as mycotoxins. These secondary metabolites produced by fungi can produce serious health problems if not adequately controlled. Patulin, a mycotoxin that can promote health problems such as immunosuppressive, genotoxic, mutageneic and nephrotoxic effects, is present mainly in apples and apple-based foods, including those commonly consumed by children, such as baby purees or fruit juices. Since the most frequent exposure route for food contaminants is ingestion, the impact of the digestion process on the availability and absorption of these compounds should be well characterized. The present study aimed to determine the patulin bioaccessibility, fraction…. variation throughout the different stages of the digestive process of apple-based fruit suices, using the harmonized in vitro digestion method. This method differs from other digestion methods because it is based on harmonized conditions and it includes a previous step for the determination of enzymatic activities. The mean bioaccessibility values were evaluated in 4 samples of apple juice in the oral, gastric and intestinal phases. To evaluate the impact of the digestion process on the bioaccessibility of patulin, artificially contaminated apple were used. The identification and quantification of patulin were performed by liquid chromatography with ultraviolet detection and solid phase extraction (SPE-HPLC-UV). According to the author's knowledge, this is the first study describing the bioaccessibility of patulin in apple based juices, during the three phases of the digestion process, applying the harmonized in vitro digestion method. The bioacessibility results of patulin revealed values ranging from 56.8% to 94.1 in the oral phase, 62.2% and 98.0% in the gastric phase, and 5.4% and 51.2% in the intestinal phase. The gastric phase shows the highest average bioaccessibility values (79.3 ± 9.6), close to those determined in the oral phase (77, 8 ± 11.8%). On the other hand, intestinal phase, presents the lowest average bioaccessibility values determined (21.6 ± 16.2%). There were no statistically significant differences between mean values of bioaccessibility from oral and gastric phases (p value = 0.828). However, statistically significant differences were found between the oral - gastric and intestinal phases (p value <0.05), thus suggesting that most of the bioacessibility reduction of patulin occurs during the intestinal phase. p valuep valueThe comparison between different food matrices, cloudy and clear, shows very similar values of bioaccessibility in the first two phases of the digestive process, namely oral (clear: 77,2 ± 18,0 %; cloudy: 78,4 ± 9,7 %) and gastric (clear: 79,9 ± 16,3 %; cloudy: 78,6 ± 3,3 %). In the intestinal phase, the results show differences between the clear matrix juices (18.0 ± 4.7%) and the cloudy ones (25.6 ± 26.8). There were no significant differences between different matrices, considering each phase of the digestive process (p values obtained - Oral: 0.939; Gastric: 0.821; Intestinal: 1). Due the obtained results in this study, that revealed high levels of bioaccessibility of patulin in the gastric phase, and considering that children are frequent consumers of apple-based foods, it is considered extremely important to assess the risk associated with children's exposure to these products. In the future, it is suggested to increase the number of bioaccessibility studies of patulin using the harmonized method of in vitro digestion, in apple products and other fruits consumed by children. The possibility of applying new in vitro digestion methods to simulate infant digestion should be further evaluated, as this process presents differences in digestion in an adult. Particular importance should be given to the new in vitro infant digestion methods, which have been recently developed and will contribute to perform a more detailed risk assessment of child exposure to patulin through ingestion of fruit-based food.

Este trabalho foi realizado no âmbito do projeto "MycoMix" (PTDC/DT-PFTO/0417/2012), financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia.

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