Analysis of extracellular proteostasis and exercise training in patients with heart failure | Análise da proteostase extracelular e do exercício físico em pacientes com insuficiência cardíaca

Despite significant advances in the treatment of heart failure (HF), patients with HF still present poor quality of life and reduced survival rates. The elucidation of molecular and cellular mechanisms underlying HF development is thus of outmost importance and may assist in the design of more effective therapeutic strategies. Deterioration of protein quality control (PQC) mechanisms and the consequent increase in proteins’ misfolding and aggregation, have been associated with HF development and progression. Additionally, exercise training, which is a recommended adjuvant therapy for HF, has been shown to restore proteostasis and reduce protein aggregate levels in the myocardium from animal models of HF. However, since the study of PQC-related pathophysiological mechanisms usually requires tissue biopsies, deepened knowledge may arise from the study of proteostasis in extracellular body fluids. Findings related to extracellular proteostasis may even lead to the development of minimally invasive biomarkers for detection and/or monitorization of protein aggregation in HF. This thesis aims to characterize the extracellular proteostasis and protein aggregation in plasma from patients with HF, and to determine whether a 12-week exercise training can reduce the circulating levels of protein aggregates and improve extracellular proteostasis in this clinical condition. To achieve these goals, extracellular proteostasis was evaluated in plasma samples through different methodologies. SDS-resistant protein aggregates (SRA) were resolved by diagonal two-dimensional SDSPAGE and their protein content was identified by mass spectrometry. Oligomeric and fibrillar species and other proteostasis-related markers were detected by immunoblotting techniques. Changes in the protein’s conformational profiles were assessed by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, supported by multivariate analysis. Our results revealed that HF patients with preserved ejection fraction (HFpEF) presented higher levels of SRA than age-matched individuals. SRA were composed of proteins usually found extracellularly, some of which already associated with cardiovascular function and/or disease and with chaperone activity. Reduced levels of plasma ficolin-3 were found in patients with HFpEF. Additionally, HF patients with reduced ejection fraction (HFrEF) showed increased levels of oligomeric species and decreased amounts of the chaperone clusterin, in comparison to the age-matched group. In addition, FTIR analysis of protein amide I absorption region helped to discriminate HF patients from age-matched individuals, where HF samples were mainly associated with the typical peaks of aggregationprone structures. Finally, after 12 weeks of exercise training, HFrEF patients showed reduced plasma SRA load and increased haptoglobin levels, as well as improved cardiorespiratory fitness and quality of life and decrease NT-proBNP levels. Overall, this work showed that HF patients seem to have impaired extracellular proteostasis, whereas exercise training may improve the PQC systems, potentially via haptoglobin-mediated action.

Apesar dos avanços significativos no tratamento da insuficiência cardíaca (IC), os pacientes com IC apresentam reduzida qualidade de vida e baixa taxa de sobrevivência. A elucidação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao desenvolvimento de IC é, portanto, de extrema importância e pode ajudar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. A deterioração dos mecanismos de controlo da qualidade proteica (CQP) e o consequente aumento de proteínas incorretamente enoveladas e agregadas têm sido associados ao desenvolvimento e progressão da IC. No entanto, o exercício físico, considerado uma terapia adjuvante para a IC, tem demonstrado restaurar a proteostase e reduzir os níveis de agregados proteicos no miocárdio em modelos animais de IC. Contudo, dado que o estudo dos mecanismos associados à disfunção do CQP na IC requer, geralmente, a utilização de biópsias, a avaliação da proteostase extracelular em fluidos corporais pode facilitar o estudo destes mecanismos. Estes estudos podem, inclusivamente, conduzir ao desenvolvimento de biomarcadores minimamente invasivos para a deteção e/ou a monitorização da agregação proteica na IC. A presente tese visa caracterizar a proteostase extracelular e a agregação proteica no plasma de pacientes com IC, e determinar se 12 semanas de exercício físico podem reduzir os níveis circulantes de agregados proteicos e melhorar a proteostase nesta condição clínica. Para alcançar estes objetivos, a proteostase extracelular foi avaliada em amostras de plasma através de diferentes metodologias. Os agregados proteicos resistentes ao SDS (‘SRA’) foram resolvidos por SDS-PAGE bidimensional diagonal e o seu conteúdo proteico foi identificado por espectrometria de massa. As espécies oligoméricas e fibrilares, bem como outros marcadores associados à proteostase foram detetados através de técnicas de imunodeteção. As alterações nos perfis conformacionais das proteínas foram avaliadas por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) com análise multivariada. Os resultados revelaram que os pacientes com IC com fração de ejeção preservada (ICFEP) apresentaram níveis superiores de SRA comparativamente aos indivíduos da mesma idade sem IC. Nos SRA, identificaram-se proteínas geralmente presentes no meio extracelular, algumas das quais já associadas à função e/ou doença cardiovascular e com atividade de chaperona. Os pacientes com ICFEP mostraram níveis reduzidos de ficolina-3 plasmática. Além disso, os pacientes com IC com fração de ejeção reduzida (ICFER) apresentaram níveis elevados de espécies oligoméricas e quantidades reduzidas de clusterina em comparação com o grupo da mesma idade sem IC. A análise de FTIR da região de absorção da amida I das proteínas permitiu discriminar os doentes com IC dos indivíduos da mesma idade sem IC, sendo que as amostras de IC foram principalmente associadas aos picos típicos de estruturas propensas à agregação. Finalmente, ao fim de 12 semanas de exercício físico, os pacientes com ICFER apresentaram uma redução na quantidade de SRA e um aumento dos níveis de haptoglobina, bem como melhoria da aptidão cardiorrespiratória e da qualidade de vida e diminuição dos níveis de NT-proBNP. No geral, este trabalho indica que os pacientes com IC parecem ter uma proteostase extracelular comprometida, e que o exercício físico poderá melhorar a proteostase, incluindo os sistemas de CQP, potencialmente através da ação da haptoglobina.

Programa Doutoral em Biomedicina