Diagnostic methods for immune-related pulmonary diseases | Métodos de diagnóstico para doenças pulmonares com uma componente imunitária

The development of clinical laboratory assays to help interpret medical examination is essential for the early diagnosis of rare diseases, facilitating their management and treatment. Two diseases were studied in this project: autoimmune pulmonary alveolar proteinosis (aPAP) and chronic hypersensitivity pneumonitis (HP). Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) autoantibody is a biomarker of autoimmune pulmonary alveolar disease, with elevated levels resulting in impaired GM-CSF signalling, and on the surfactant alveolar accumulation and consequently lung dysfunction. This protein can be easily detected in plasma samples by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Comparing the levels of GM-CSF autoantibody present in plasma samples from healthy individuals along with patients with suspicion of aPAP and individuals diagnosed with aPAP is helpful in the clinical diagnosis of the autoimmune form of the disease. Chronic hypersensitivity pneumonitis develops following exposure to certain inciting agents (microoganisms, avian proteins, metals, chemicals…). The key feature of this disease is an excessive migration and proliferation of primed T lymphocytes into the alveolar parenchyma as a consequence of chronic pre-sensitization to the agent (antigen/allergen). An in vitro lymphoproliferation assay was developed to assess delayed-type hypersensitivity in response to different stimulus. The measurement of the proliferative response of primed T-lymphocytes stimulated with mitogen or antigen/allergen, by flow cytometry is possible with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) dilution. Using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) isolated from healthy donors, proliferation was detected following challenge with phytohaemagglutinin (PHA) or inactivated (heat and chemically) C. albicans yeast cells. Optimization of this assay for patients with suspicion of hypersensitivity pneumonitis will contribute for the identification of the inducing causal agent of the inflammatory response, enabling the treatment and avoidance of the exposure that could be causing or aggravating the disease. Implementation of these assays will be valuable for the early detection of rare pulmonary diseases

O desenvolvimento de ensaios para clínica laboratorial que auxiliem no diagnóstico precoce de doenças raras, em conjunto com os exames de diagnóstico médico, é essencial para a sua gestão e tratamento. Neste projeto foram estudadas duas doenças: a proteinose alveolar pulmonar autoimune (aPAP) e a pneumonite de hipersensibilidade crónica (HP). O autoanticorpo contra o fator estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é um biomarcador da proteinose alveolar pulmonar autoimune, que quando presente em níveis elevados compromete a sinalização GM-CSF, levando à acumulação de surfactantes nos alvéolos e consequentemente a disfunção pulmonar. Esta proteína pode ser facilmente detetada em amostras de plasma através de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Comparando os níveis de autoanticorpos contra GM-CSF presentes tanto em amostras de plasma de indivíduos saudáveis como pacientes com suspeita de aPAP ou diagnosticados com a doença, torna-se útil para o diagnóstico clínico da forma autoimune da doença. A pneumonite de hipersensibilidade crónica desenvolve-se após exposição a certos agentes indutores (microorganismos, proteínas aviárias, metais, químicos…). A característica diagnosticante desta doença é a migração e proliferação excessiva para o parênquima alveolar por parte de linfócitos T prévia e cronicamente sensitizados para um determinado agente(s) (antigénico/alergénico). Foi desenvolvido um ensaio de linfoproliferação in vitro para avaliar hipersensibilidade mediada por células em resposta a diferentes estímulos. Através de citometria de fluxo e com a marcação prévia com éster sucidinil de carbofluoresceína (CFSE), pode ser medida esta resposta proliferativa dos linfócitos T sensitizados devido à estimulação com mitogénio ou antigénio/alergénio. Utilizando células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas de dadores saudáveis, foi possível detetar a proliferação induzida por fitohemaglutinina (PHA) e leveduras C. albicans inactivadas (por temperatura ou quimicamente). A optimização deste ensaio para pacientes com suspeita de pneumonite de hipersensibilidade para identificar o agente indutor da resposta inflamatória permitirá o seu tratamento, evitando a exposição ao agente que está a causar ou agravar a doença. A implementação destes ensaios pode ser fundamental na deteção precoce de doenças pulmonares com uma componente imune.

Mestrado em Biomedicina Molecular