Aplicação da biologia molecular no estudo da criptosporidiose neonatal bovina: diagnóstico molecular e epidemiológico

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

A criptosporidiose é reconhecida como um problema de saúde pública. Os protozoários Cryptosporidium spp. são responsáveis por uma das mais importantes doenças gastrointestinais em crianças, indivíduos imunodeprimidos e animais no pré-desmame. A infeção por Cryptosporidium spp. é endémica nos bovinos por todo o mundo e é uma das mais importantes causas de enterite em vitelos, dando origem a um quadro de diarreia profusa, desidratação e, em casos mais graves, mesmo morte do animal. Mais de um século passou após a descoberta destes parasitas, que permanecem como agentes de difícil controlo na produção animal e no meio ambiente. As medidas terapêuticas disponíveis para o controlo da doença são de eficácia limitada, sendo que apenas reduzem a excreção do parasita, permanecendo a disseminação de oocistos infetantes. Com base em vários estudos, as vacinas surgem como um futuro terapêutico promissor, mas a sua eficácia requer estudos de campo para ser comprovada. Este trabalho teve como objetivos principais: (a) detetar e quantificar Cryptosporidium spp. em vitelos de seis explorações leiteiras, nas duas primeiras semanas de vida; (b) analisar indicadores de saúde de forma a comparar os sinais clínicos com a positividade ao agente. Teve ainda como objectivos secundários, avaliar a ação in vivo do alimento mineral Nova Calforce® na excreção de Cryptosporidium spp e inferir as práticas de maneio instituídas nas explorações que promovem a infeção. Foram incluídos neste estudo 101 animais com idades compreendidas entre os 7 e os 15 dias, tendo sido formados dois grupos em cada exploração, um grupo controlo e um grupo sujeito a tratamento. Para deteção e quantificação de Cryptosporidium spp., foram aplicadas as técnicas de nested-PCR e a técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR) nas amostras fecais recolhidas. Inquéritos de exploração foram instituídos de forma a identificar os fatores de risco, permitindo promover possíveis alterações de maneio para a prevenção e controlo da doença. As prevalências obtidas nas diferentes explorações variaram entre 75 a 100%, com uma excreção média de 9,28 x 107 oocistos / g de fezes. Relativamente ao ensaio com Nova Calforce®, verificou-se em média, que os valores de oocistos excretados foram menores no grupo sujeito a tratamento, embora sem significância estatística (p=0,2847). A técnica de qPCR apresentou elevada sensibilidade para o diagnóstico de animais numa fase precoce de infeção antes do aparecimento de sinais clínicos e em casos de infeção subclínica com elevados níveis de excreção. Perante os resultados obtidos, torna-se importante a identificação de fatores de risco e dos animais que influenciam a resistência e perpetuam a doença na exploração, criando estratégias de maneio na exploração de forma a minimizar a disseminação dos agentes

Abstract Cryptosporidiosis is a major important public and animal health concern. The protozoa Cryptosporidium spp. is one of the most important enteric parasites in children, immunocompromised people, and pre-weaned animals. Cryptosporidiosis is an endemic disease spread all over the world, and has a significant impact upon animal production, especially in young calves, which leads to a profuse and watery diarrhoea, dehydration and in some cases, death. After the discovery of this parasite, more than a century has passed by, and this protozoan continues to be a serious and difficult parasite to control in animal breeding and in the environment. Unfortunately, few tools are available to combat the disease and their efficacy is limited and shown to ineffective in the prevention of oocyst shedding. However, many studies mention that vaccines will be the future innovative treatment, yet their efficacy needs to be demonstrated in the field. The goals of this study were to detect and quantify Cryptosporidium spp. in calves of six dairy farms, during the first two weeks of their life; identify the clinical signs of the infected calves; investigate the risk factors associated with the spread of infection by Cryptosporidium spp., and at the same time evaluate the in vivo impact of the liquid mineral feed Nova Calforce® on the oocyst shedding of Cryptosporidium spp. In this study a total 101 calves were included in this study with ages between 7 and 15 days, and two groups from each farm were formed, one group with treatment and the other, the control group, with no treatment given. For Cryptosporidium detection and quantification, nestedPCR and qPCR techniques were performed on the faecal samples collected. A questionnaire was designed and administered to farmers to collect data about their farming practices, which led to the identification of risk factors associated to Cryptosporidium infection and which also led a discussion regarding the changes of practices that should be implemented to prevent and control the disease. Farm prevalence ranged from 75 to 100% and the mean number of oocysts shed per gram of faeces estimated was 9,28x107 . Concerning the impact of Nova Calforce®, the number of oocysts shed by the treated group were less, although, without statistical significance. Quantitative real-time PCR proved to be a sensitive test during the neonatal period and appears to be the ideal method for identifying animals in the early stages of infection before clinical signs become evident or during an asymptomatic infection with high levels of oocyst shedding. To conclude, the data derived from this study shows the importance of the identification of risk factors and which animals influence disease resistance and maintenance in farms and also the importance of creating strategies to minimize the transmission of the parasite.