Criopreservação de espermatozóides epididimários em equinos : comparação entre dois métodos

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária

Em caso de morte inesperada, acidente ou mesmo castração eletiva de um garanhão é possível recuperar e criopreservar espermatozoides viáveis da cauda do epidídimo (Bruemmer, 2006). Inclusivamente, o primeiro relato de um poldro nascido após inseminação artificial (IA) com sémen congelado foi o resultado de uma inseminação com espermatozóides epididimários (Barker & Gandier, 1957). Os espermatozóides da cauda do epidídimo têm algumas características diferentes em termos de refrigeração e criopreservação, pois são células que nunca contactaram com os restantes fluidos seminais, em comparação com espermatozóides obtidos de uma ejaculação. Neste trabalho pretende-se comprovar a eficácia de uma das técnica de colheita de espermatozóides do epidídimo: a técnica do flushing retrógrado (Bruemmer, 2006), em testículos refrigerados a 5ºC 24h após castração, bem como comparar o efeito de dois métodos de criopreservação na motilidade e viabilidade dos espermatozóides. Ainda, pretende-se efetuar a comparação da motilidade, pós-descongelação, e número de células espermáticas obtidas, entre a colheita de ejaculado pré-castração com vagina artificial e a colheita de espermatozóides da cauda do epidídimo, no mesmo cavalo. Para tal, fez-se a recolha dos espermatozóides da cauda do epidídimo num total de 12 cavalos, entre os 3,5 e os 10 anos de idade, de diferentes raças; após colheita, criopreservou-se os espermatozóides de cada cavalo com dois diluidores de congelação para sémen de equino: Botucrio® (Bc) e Gent diluído de 1:1 com diluidor de leite desnatado (Gd). Em cinco destes cavalos, cinco ejaculados foram recolhidos pré-castração com vagina artificial e criopreservados. Obteve-se uma média de 15688 +/- 2432 milhões de espermatozóides recolhidos da cauda do epidídimo por cavalo (n=12). Após descongelação, avaliou-se a motilidade, total (MT) e progressiva (MP), e a viabilidade, através de coloração com sondas fluorescentes e através do teste hipo-osmótico (HOST). Obteve-se uma MT e MP, respetivamente, de 49,5 +/- 2,8% e 26.4 +/- 10.4%, no grupo Bc, e de 14,1 +/- 2,9% e 4,05 +/- 5,08%, no grupo Gd. O número de espermatozóides viáveis, segundo o teste de coloração e HOST, respetivamente, foi de 47,1 +/- 2,3% e 65,5 +/- 2,0%, para o grupo Gd e 40,7 +/- 2,0% e 50,6 +/- 1,5 %, para o grupo Bc. O diluidor de congelação Botucrio® obteve resultados satisfatórios na preservação da motilidade e viabilidade de espermatozóides epididimários. A motilidade dos espermatozóides epididimários e do ejaculado, pós-descongelação, foi semelhante em 3 de 5 cavalos e o número de espermatozóides obtidos por colheita da cauda do epidídimo foi de duas a dez vezes superior ao de um ejaculado.

ABSTRACT - FREEZING OF EQUINE EPIDIDYMAL SPERM: COMPARISON BETWEEN TWO METHODS - In the event of unexpected death, catastrophic injury, or even elective castration, stallion sperm capable of fertilization can be recovered from the epididymal cauda and frozen for future use (Barker & Gandier, 1957; Bruemmer, 2006; Morris, Tiplady, & Allen, 2002). The first report of a foal born after artificial insemination with frozen semen was the result of an insemination with epididymal spermatozoa (Barker & Gandier, 1957). Epididymal spermatozoa have some different characteristics in terms of refrigeration and cryopreservation, because they never contacted other seminal fluids, compared to spermatozoa obtained in an ejaculation. In this study we intend to prove the efficacy of the retrograde flushing technique in harvesting epididymal spermatozoa from the cauda epididymis, in refrigerated testicles at 5ºC 24h after castration, as well as to compare two methods of cryopreservation. Finally, it is intended to compare the motility and number of sperm cells obtained between the ejaculate, collected using the artificial vagina, and the spermatozoa harvested from the epididymal cauda, on the same horse. For this, the spermatozoa were harvested from the epididymis in12 horses, from 3.5 to 10 years of age, of different breeds; and the semen of each horse was cryopreserved with two freezing extenders for equine semen: Botucrio® (Bc) and Gent diluted 1: 1 with skim milk-based extender (Gd). In five of these horses, several ejaculates were previously collected with artificial vagina and cryopreserved. An average of 15688 +/- 2432 million sperm was collected from the tail of the epididymis per horse. After thawing, total and progressive motility was assessed for both groups, as well as the sperm viability obtained by two methods: staining with fluorescent probes and by the hypo-osmotic swelling test (HOST). A total and progressive motility was obtained, respectively, of 49.5 +/- 2.8 % and 26.4 +/- 10.4 %, in group Bc, and of 14.1 +/- 2.9 e 4.05 +/- 5.08 %, in group Gd. The number of viable spermatozoa, according to the staining test and HOST, respectively, was 47.1 ± 2.3% and 65.5 ± 2.0%, for the Gd group and 40.7 ± 2.0% and 50.6 ± 1.5% for the Bc group. The freezing extender Botucrio® obtained satisfactory results in the preservation of the motility and viability of epididymal spermatozoa. Sperm motility of ejaculate and epididymal semen, post-thaw, was similar in 3 of 5 horses and the number of spermatozoa harvested from the cauda epididymis was two to ten times superior to the obtained in one ejaculate.

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