Molecular identification of mosquito species : Evaluation of a rapid DNA extraction method together with DNA barcoding as a tool for identification of species

The current method to determine a mosquito specimen to a certain species is by morphological keys basically following the taxonomy developed by Carl Linnaeus in the 1700. Since Watson and Crick presented their model of the double-helix DNA in 1953, a new era of molecular based taxonomic studies have revolutionized the field. The revolution is not in terms of how the classification of species is done but how the biological diversity is seen. However, morphological, ecological and behavioral characteristics are still important and are used together with the information a gene or whole genome can give. DNA barcoding is one of the promising methods for molecular identification. A small segment of a gene, approximately 400-1000 base pairs (bp), are examined by a Polymerase chain reaction (PCR) and sequencing. Like the barcodes in the grocery store these sequences work like unique ID: s for every species. This thesis shows how a fast DNA extraction method could be combined with DNA barcoding to get a 658-bp segment of the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) from different species of the mosquito family Culicidae. A total of 15 thoraxes or wings, from individual specimen of mosquitoes, were examined and 11 different barcode sequences could be retrieved. Six correspond to already published COI sequences and could therefore be determined to the species level, including a sequence from a new species for Sweden, Aedes (Ochlerotatus) nigrinus. All mosquitoes were collected during the national inventory of species in summer of 2012 in Sweden, ”Myggjakten”, and have been morphological examined by experts at the National Veterinary Institute (SVA) prior to molecular determination. This thesis also highlights the importance of building a reference library of barcode sequences, so DNA barcoding could become an effective diagnostic tool. Inventory projects like “Myggjakten” may, if repeated, provide excellent material for such a library collection of barcode data.

När en stickmyggsart skall artbestämmas är den vanligaste metoden att använda morfologiska nycklar. I princip görs det här efter den taxonomi som Carl von Linne utvecklade på 1700-talet. Men sedan Watson och Crick presenterade sin DNA modell 1953 så har dock en ny era av molykylärt baserade metoder revolutionerat taxonomin. Förändringen består egentligen inte i hur vi klassificerar och använder taxonomin utan mer hur vi ser på den biologiska mångfalden. Morfologiska och ekologiska studier, samt studier av arters beteende, är fortfarande viktiga och komplementerar den molekylära informationen från ett genom eller från en enstaka gen. DNA barcoding är en av de lovande nya molekylära metoderna för artbestämning. Ett litet segment av en gen, på ungefär 400-1000 baspar (bp), undersöks med hjälp av polymeras-kedjereaktion (PCR) och sekvensering. Likt streckkoder i livsmedelsbutiken ger metoden ett unikt ID för varje art. Den här studien visar hur en snabb DNA-extraktionsmetod kan kombineras med DNA barcoding, för att ge en 658-bp lång DNA-sekvens, från den mitokondriella genen cytokrom c oxidas subunit 1 (COI) från olika arter av myggfamiljen Culicidae. I undersökningen ingick 15 mellankroppar eller vingar från individuella stickmyggor och av dessa kunde 11 olika barcode sekvenser utläsas. Sex av dessa stämde överrens med redan publicerade COI-sekvenser och kunde bestämmas till artnivå, varav en av sekvenserna kommer från den nyligen i Sverige funna morfologiskt artbestämda Aedes (Ochlerotatus) nigrinus. Stickmyggorna i detta arbete insamlades av privatpersoner på olika ställen i Sverige under sommaren 2012 i det nationella mygginsamlingsprojektet ”Myggjakten”. Dessa artbestämdes morfologiskt av personal på Statens veterinärmedicinska anstalt (SVA) innan de artbestämdes molekylärt. Det här arbetet belyser även vikten av att bygga upp ett referensbibliotek av barcode sekvenser för att DNA-barcoding ska kunna bli ett effektivt diagnostiskt verktyg vid studier av vektorburna zoonoser. Nationella projekt som Myggjakten kan vara mycket användbara för insamling av sådana data.