The optimized method to isolate heterologous dsRNA expressed in Escherichia coli HT115(DE3) | Оптимизация метода выделения двуцепочечной РНК, гетерологично экспрессированной в Escherichia coli HT115(DE3)

English. The effectiveness of RNA interference (RNAi) in suppressing the transcriptional activity of target genes of insect pests, phytopathogenic viruses, and fungi determines the interest in the biosynthesis of double-stranded RNA (dsRNA) in bacteria Escherichia coli as a less expensive technology compared to in vitro synthesis. The rersearch goal was to create an original vector for the efficient expression of dsRNA molecules in E. coli HT115(DE3), as well as to optimize the conditions for extracting nucleic acids from bacterial cells, treating them with RNase A and subsequent isolation of dsRNA using acid phenol. To construct a new vector producing dsRNA in E. coli HT115(DE3), we used the pRSETа plasmid (Thermo Fisher Scientific, USA) without the region encoding the N-terminal recombinant tag. Ligation of Leptinotarsa decemlineata and Myzus persicae gene fragments into a new vector, subsequent transformation of E. coli HT115(DE3) cells with these constructs, expression and isolation of dsRNA demonstrated the high efficiency of their biosynthesis, comparable to that of traditional L4440 vector. Optimization of conditions for the extraction of nucleic acids from bacterial cells before their treatment with RNase A showed the effectiveness of ultrasonication as well as heating in water at 95 deg. C. To remove single-stranded RNA, the optimal content in the reaction mixture was 0.4 M NaCl and 1.25 mkg/mL of RNase A (Thermo Fisher Scientific, USA). Treatment of the reaction mixture with acid phenol (pH 4.0) and then with chloroform is necessary not only for selective extraction of dsRNA, but also for inactivation of stable RNase A. The reaction mixture treatment with chloroform alone did not lead to complete inactivation of the enzyme. The amount of dsRNA isolated from bacteria sonicated before treatment with RNase A under selected conditions with used equipment was 9.1±1.2 mkg/mL of culture.

Russian. Эффективность РНК-интерференции (РНКи) в подавлении транскрипционной активности генов-мишеней у насекомых-вредителей, фитопатогенных вирусов и грибов определяет интерес к биосинтезу двуцепочечной РНК (дцРНК) в бактериях Escherichia coli как менее затратной технологии по сравнению с синтезом in vitro. Нашей целью было конструирование оригинального вектора для эффективной экспрессии молекул дцРНК в бактериях Escherichia coli HT115(DE3), а также оптимизация условий выделения нуклеиновых кислот из бактериальных клеток, обработки экстрактов РНКазой А и последующего выделения дцРНК с использованием кислого фенола. При создании нового вектора для получения дцРНК в бактериях E. coli HT115(DE3) мы использовали плазмиду pRSETа (Thermo Fisher Scientific, США) без участка, кодирующего N-концевой рекомбинантный таг. Встраивание в новый вектор фрагментов генов Leptinotarsa decemlineata и Myzus persicae, последующая трансформация бактерий E. coli HT115(DE3) созданными конструкциями, экспрессия и выделение молекул дцРНК продемонстрировали высокую эффективность их биосинтеза, сравнимую с таковой для традиционного вектора L4440. Оптимизация условий экстракции нуклеиновых кислот из бактериальных клеток для последующей обработки экстрактов РНКазой А показала эффективность обработки ультразвуком, а также прогревания в воде при 95 град. С. Для удаления одноцепочечной РНК оптимальным оказалось присутствие в реакционной смеси 0,4 М NaCl и 1,25 мкг фермента РНКазы А (' Thermo Fisher Scientific', США) на 1 мл реакционной смеси. Обработка реакционной смеси кислым фенолом (рH 4,0), а затем хлороформом необходимы не только для избирательной экстракции дцРНК, но и для инактивации стабильной РНКазы А. Обработка реакционной смеси только хлороформом не приводила к полной инактивации фермента. Количество дцРНК, выделенной из бактерий, которые были обработаны ультразвуком перед инкубацией с РНКазой А, при подобранных в исследовании условиях и использованном оборудовании составило 9,1±1,2 мкг/мл культуры.