Hacia el uso de carotenoides incoloros como ingredientes funcionales de alimentos.

Durante el periodo de la tesis se llevaron a cabo estudios in vitro para evaluar la bioaccesibilidad del fitoeno (PT) y del fitoflueno (PTF) en varias matrices alimentarias y determinar su eficiencia en la micelización y ensayos celulares para estudiar la captación y el eflujo intestinal de los mismos. Con estos estudios se trató de evaluar varios aspectos de estos carotenoides que son útiles para su uso como ingredientes funcionales de alimentos y/o productos relacionados y de identificar las posibles características diferenciales entre estos carotenoides y otros carotenoides biodisponibles de la dieta. En primer lugar, con el fin de obtener información de base para el desarrollo de la tesis, se realizó un estudio bibliográfico que dio lugar a un capítulo de libro y dos revisiones que se han incluido como parte de la introducción de la presente tesis. En los primeros estudios experimentales se evaluó la bioaccesibilidad del PT y del PTF de varias matrices alimentarias ricas en estos carotenoides mediante digestiones in vitro gastrointestinales. Las matrices evaluadas fueron varios zumos comerciales de frutas y de hortalizas, un zumo de naranja de la variedad Pinalate (mutante rica en carotenoides incoloros), un tomate fresco común, un tomate fresco tipo cherry y dos productos de tomate en polvo. En estos estudios se observó cómo, con carácter general e independientemente de la matriz analizada, la bioaccesibilidad del PT era algo superior a la del PTF y cómo las bioaccesibilidades de ambos eran superiores a la de otros carotenoides biodisponibles presentes en las matrices, siendo particularmente superiores a la del licopeno, otro caroteno lineal. Por ejemplo, en el zumo de tomate, una de las frutas con mayor contenido en estos carotenoides, la bioaccesibilidad del PTF y del PT (50 y 62%, respectivamente) fue aproximadamente 3 y 4 veces superior a la del licopeno, respectivamente. Dado que los diferentes isómeros geométricos del PT y del PTF mostraron, al contrario que los del resto de los carotenoides analizados, bioaccesibilidades similares entre sí, la mayor proporción de isómeros cis de los mismos presentes en la mayoría de las matrices en relación a la del resto de los carotenoides analizados podría no ser la causa principal de la mayor bioaccesibilidad de los mismos. Con los resultados de los estudios in vitro sobre la micelización de carotenoides se concluyó que la mayor bioaccesibilidad del PT y del PTF podría ser consecuencia de su mayor capacidad para incorporarse en las micelas mixtas durante la digestión. A pesar de que generalmente se considera que la bioaccesibilidad de un carotenoide es mayor cuanto mayor es su polaridad, la elevada capacidad de micelización y bioaccesibilidad del PT y del PTF parecían deberse, principalmente, a su mayor flexibilidad y a su característica forma molecular, que son consecuencia de su menor número de dobles enlaces conjugados en comparación con el del resto de carotenoides comunes. En el estudio con muestras de tomate en polvo se pudo comprobar como la adición de aceite de girasol conducía a un incremento de la bioaccesibilidad del PT y del PTF, ya de por sí alta. Así, de forma aproximada, se observó como la bioaccesibilidad del PT se triplicó y la del PTF se cuadriplicó tras la adición de un 5% (volumen/peso fresco) de aceite. Por otra parte, se analizó el efecto de varios tratamientos térmicos en un zumo de naranja fresco de la variedad Pinalate en la concentración y en la bioaccesibilidad de los carotenoides principales presentes en la matriz y en el color del zumo. Se observó cómo todos los tratamientos estudiados producían una disminución significativa de la concentración de los carotenoides incoloros (p < 0,05). Se llegó a la conclusión de que ciertos tratamientos térmicos producían un aumento significativo (p < 0,05) de la bioaccesibilidad de los carotenoides incoloros como consecuencia de la degradación del material celular (observado mediante microscopía) y de la disminución del tamaño de partícula (analizado mediante el estudio de la distribución del tamaño de partícula). El zumo pasteurizado fue el que generó mayores diferencias con el zumo fresco en relación a la degradación de las estructuras celulares, el tamaño de partícula, el color, la concentración de carotenoides y la bioaccesibilidad de los mismos. Entre los zumos de frutas y de hortalizas comerciales analizados, el zumo de tomate fue el que tuvo una mayor concentración en carotenoides incoloros y el que proporcionó un mayor contenido bioaccesible de estos carotenoides. Así, el consumo de 250 mL de zumo de tomate, al que se le adicionó un 33% de crema para café como fuente de grasa, resultaría en 5,8 mg de PT y 2,2 mg de PTF ingeridos y proporcionaría 3,6 mg de PT y 1,1 mg de PTF bioaccesibles. A continuación, se procedió a estudiar el proceso de captación y eflujo intestinal en células Caco-2. La eficiencia de captación intestinal del PTF y del PT fue similar a la de la luteína y superior a la del licopeno (29, 21, 26% y no detectable, respectivamente). Estudios de competencia por la captación intestinal mostraron que la presencia de PTF, β-caroteno o luteína micelar en la cámara apical disminuía significativamente la captación del PT micelar (p < 0,001), mientras que solo la luteína micelar, entre los carotenoides analizados, producía una disminución significativa de la captación de PTF micelar (p < 0,001). Mediante el uso de células Caco-2 y HEK se confirmó que la proteína SR-BI estaba implicada en la captación intestinal del PT y del PTF. Se observó que parte del PT y del PTF micelar captado, en particular aproximadamente el 14%, podía sufrir eflujo de vuelta a la cámara apical. Este estudio parece ser el primero en el que se obtienen evidencias experimentales que indican que los carotenoides pueden sufrir eflujo intestinal.

During the period of this doctoral thesis, in vitro studies were carried out to evaluate the bioaccessibility of phytoene (PT) and phytofluene (PTF) in several food matrices and to determine their micellization efficiencies and cellular experiments were performed to study their intestinal uptake and efflux. With these studies we tried to evaluate several aspects of these carotenoids that are useful for their use as functional ingredients of food and / or related products and to identify the possible differential characteristics between these carotenoids and other bioavailable carotenoids of the diet. The aims of these studies were try to evaluate several aspects of these carotenoids that are useful for their use as functional ingredients of food and/or related products and to identify the possible differential characteristics between these carotenoids and other bioavailable carotenoids of the diet. First of all, a bibliographical study was conducted in order to obtain basic information for the development of the thesis. One book chapter and two reviews, which have been included as part of the introduction of the present thesis, were the fruits of this labour. In the first experimental studies, the bioaccessibility of PT and PTF in several foods rich in them was evaluated by in vitro gastrointestinal digestions. The matrices evaluated were several commercial juices of fruit and vegetables, an orange juice of the Pinalate variety (a mutant rich in colourless carotenoids), a fresh common tomato, a fresh cherry tomato and two tomato powder products. In these studies, it was observed that, in general and independently of the analysed matrix, the bioaccessibility of PT was slightly higher than that of PTF and that the bioaccessibility of both was superior to that of other bioavailable carotenoids present in the matrices, being particularly superior to that of lycopene, another linear carotene. For example, in the tomato juice, one of the fruits with the highest content of these carotenoids, the bioaccessibility of PTF and PT (50 and 62%, respectively) was approximately 3 and 4 times higher than that of lycopene, respectively. Given that the different geometrical isomers of PT and PTF showed, unlike the rest of the carotenoids analysed, similar bioaccessibilities to each other, the higher proportion of cis isomers of PT and PTF present in most of the matrices in relation to that of the rest of the analysed carotenoids may not be the main cause of their greater bioaccessibility. The in vitro micellization studies indicated that the higher bioaccessibility of PT and PTF could be a consequence of its greater capacity to be incorporated in mixed micelles during digestion. Although it is widely accepted that the greater the polarity of a carotenoid, the greater its bioaccessibility, the high micellization efficiency and bioaccessibility of PT and PTF seemed to be due, mainly, to its greater flexibility and its characteristic molecular shape, which are a consequence of its lower number of conjugated double bonds compared to that of the rest of common carotenoids. In the study with the tomato powder samples, it was observed that the addition of sunflower oil increased the bioaccessibility of PT and PTF, which was already high. Approximately, the bioaccessibility of PT tripled and that of PTF quadrupled after the addition of 5% (volume / fresh weight) of oil. On the other hand, the effect of several thermal treatments in a fresh juice of the Pinalate orange on the concentration and bioaccessibility of the main carotenoids present in the matrix and in the colour of the juice was analysed. It was noted that all the treatments studied produced a significant decrease in the concentration of colourless carotenoids (p < 0.05). It was concluded that certain thermal treatments produced a significant increase (p < 0.05) of the bioaccessibility of the colourless carotenoids as a consequence of the degradation of cellular material (examined by microscopy) and the decrease in particle size (analysed by studying the particle size distribution). The pasteurization was the process that gave rise to the juice with greater differences with respect to the fresh juice in relation to the degradation of the cellular structures, the particle size, the colour, and the concentration and bioaccessibility of carotenoids. Among the commercial juices analysed, the tomato juice was the sample with the highest concentration of colourless carotenoids and the juice that provided the highest bioaccessible content of them. Thus, the consumption of 250 mL of the tomato juice, to which 33% of coffee cream was added as a source of fat, would result in an intake of 5.8 and 2.2 mg of PT and PTF, respectively, and would provide 3.6 and 1.1 mg of bioaccessible PT and PTF, respectively. Subsequently, the intestinal uptake and efflux were studied by in vitro experiments using Caco-2 cells. The uptake efficiency of PTF and PT were similar to that of lutein and superior to that of lycopene (29, 21, 26% and not detectable, respectively). Competition studies for intestinal uptake showed that the presence of micellar PTF, β-carotene or lutein in the apical chamber significantly decreased the micellar PT uptake (p <0.001), whereas only micellar lutein, among the carotenoids analysed, produced a significant decrease in micellar PTF uptake (p < 0.001). By using Caco-2 and HEK cells it was confirmed that SR-BI protein is involved in the intestinal uptake of both PT and PTF. It was observed that part of the micellar PT and PTF taken up by Caco-2 cells, in particular about 14%, could undergo efflux back into the apical chamber. This seems to be the first study showing that carotenoids may suffer intestinal efflux from experimental evidences.

Premio Extraordinario de Doctorado US