GCP-basierte Lysin Dendrimere als Plattform für funktionalisierte Transfektionsvektoren

German. ZUSAMMENFASSUNG In diesem Abschnitt werden die in dieser Doktorarbeit erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst. ie vorliegende Doktorarbeit befasst sich mit der Entwicklung und Untersuchung von Lysin-Dendrimeren, welche mit GCP-Bindungseinheiten verknüpft wurden. Diese wurden als potenzielle Vektoren für die Anwendung in der Gentransfektion und der Aufklärung des Mechanismus untersucht. Das Ziel dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines neuen peptidischen Dendrimers, welches das GCP-Bindungsmotiv der Arbeitsgruppe von SCHMUCK tragen sollte. Die Transfektionsvektoren sollten aus drei Hauptbestandteilen aufgebaut sein: dem Grundgerüst (Lysine), der Bindungseinheit (GCP-Lys-Phe) und den Funktionseinheiten (NLS, EDS-NLS, Disulfid, Resveratron, Fluorescein, Rhodamin B). Im ersten Teil dieser Doktorarbeit erfolgte der Aufbau der GCP-Bindungseinheit. Dies begann mit der Verknüpfung des GCP-Bindungsmotivs mit den natürlichen Aminosäuren Lysin und Phenylalanin, um die Bindungseinheit GCP-Lys-Phe zu generieren. Diese diente als essenzielle Bindungsstelle für die DNA. Anschließend stand die Entwicklung der Grundgerüste im Vordergrund, um die Größe, die Verzweigung und den Verzweigungsgrad der Dendrimere zu bestimmen. Das Grundgerüst wurde durch die Verknüpfung mehrerer Lysine erstellt. Es konnten erfolgreich zwei- (1. Gen., LysG1), vier- (2. Gen., LysG2) und achtarmige (3. Gen.,LysG3) Lysin-Dendrimere synthetisiert werden, die jeweils mit der GCP-Bindungseinheit verbunden wurden. Diese drei synthetisierten und charakterisierten Dendrimere legten den Grundstein für weitere Untersuchungen (siehe Abbildung 47). Für die Untersuchung der Kondensationsfähigkeit der Vektoren LysG1, LysG2 und LysG3 wurde die Bildung von DNA/Vektor-Komplexen charakterisiert. Die Ergebnisse der DLS-Messungen zeigten, dass die Vektoren in der Lage sind, die negativ geladene DNA zu kondensieren und dabei optimale Größen für biologische Anwendungen zu erreichen. Die Zeta-Potential-Messungen zeigten eine konzentrationsabhängige Neutralisierung der negativen Ladung der ctDNA durch Zugabe der positiv geladenen Vektoren. Der Trend zeigte, dass mit zunehmender Anzahl positiver Ladungen eines Vektors, die Neutralisierung der DNA schneller erfolgte. Diese Untersuchungen belegen die Fähigkeit der Vektoren, DNA effektiv zu binden und in positiv geladene DNA/Vektor-Komplexe zu kondensieren. Die positiv geladenen Komplexe sind für die erfolgreiche Überwindung der elektrostatischen Abstoßung an der Zellmembran und somit für die effiziente Aufnahme von genetischem Material in die Zielzellen entscheidend. Diese grundlegende Voraussetzung stellt eine wesentliche Basis für den erfolgreichen Gentransfer dar und steigert die Effizienz der Gentransfektion. Zusammenfassend weisen die Vektoren LysG1, LysG2 und LysG3 vielversprechende Ansätze für die Anwendung als Transfektionsvektoren auf und könnten bedeutende Fortschritte in der Genforschung und Therapieentwicklung ermöglichen. Um die Eignung der Vektoren (LysG1,LysG2 und LysG3) als Transfektionsvektoren zu analysieren, wurden Transfektionsexperimente an HeLa-Zellen durchgeführt, bei denen verschiedene Konzentrationen der Vektoren verwendet wurden. Die Transfektionsexperimente zeigten, dass LysG2 bei einer Konzentration von 50 µM eine effiziente Transfektion der HeLa-Zellen erzielte, während LysG1 und LysG3 in keiner der getesteten Konzentrationen eine Gentransfektion der HeLa-Zellen erzielen konnten. Die Untersuchungen der Zellviabilität wurde mittels MTS-Assay an HeLa-Zellen durchgeführt und zeigten, dass LysG1 und LysG2 vergleichbare Auswirkungen auf die Zellviabilität haben. Ab einer Konzentration von 50 µM führten beide zu einer Viabilität von etwa 50 % bis 60 %, während höhere Konzentrationen zu einer erhöhten Toxizität und einer Viabilität von unter 50 % führten. Im Gegensatz dazu wurde bei LysG3, der acht Bindungseinheiten und damit 16 positive Ladungen aufweist, bereits bei einer niedrigen Konzentration von 10 µM eine Viabilität von unter 50 % beobachtet. Mit steigender Konzentration nahm die Zellviabilität weiter ab und bei höheren Konzentrationen wurde eine drastische Abnahme auf 10 % beobachtet, was auf eine starke Toxizität gegenüber den HeLa-Zellen hinweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Toxizität der untersuchten Vektoren von der Anzahl der Bindungseinheiten abhängt. Insgesamt verdeutlichen die Experimente, dass LysG3 im Vergleich zu LysG1 und LysG2 eine deutlich höhere Toxizität gegenüber HeLa-Zellen aufweist. Schlussfolgernd ist LysG3 aufgrund seiner hohen positiven Ladung und der daraus resultierenden Zytotoxizität für die Anwendung als Transfektionsvektor am wenigsten geeignet. Aufgrund dieser Eigenschaften von LysG3 und der Unfähigkeit zur Transfektion von HeLa-Zellen von LysG1, wurden diese Vektoren nicht weiter betrachtet. Die durchgeführten Untersuchungen hinsichtlich der Bindungsfähigkeit der Vektoren an DNA,der Transfektionseffizienz an HeLa-Zellen, sowie der Zellviabilität verdeutlichen, dass LysG2 die vielversprechendsten Eigenschaften für die Gentransfektion aufweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass LysG2 bei den untersuchten Vektoren die effektivste Bindung an DNA ermöglicht und erfolgreich genetisches Material in Zielzellen übertragen kann. Darüber hinaus zeigt LysG2 eine ausreichende Zellviabilität bei bestimmten Konzentrationen, während die Toxizität im Vergleich zu anderen Vektoren, wie LysG3, geringer ist. Aufgrund dieser vielversprechenden Eigenschaften wurde LysG2 als aussichtsreicher Kandidat für potenzielle Anwendungen in der Gentransfektion untersucht. Die Weiterentwicklung des vielversprechenden vierarmigen LysG2 wurde durch die Verknüpfung mit einer NLS-Sequenz, dem PKKKKRKV-Peptid, vorangetrieben, um die Transfektionseffizienz zu verbessern. Zusätzlich erfolgte die Verknüpfung des NLS mit einem EDS-Linker, um die sterische Anordnung und Löslichkeit zu beeinflussen. Dabei konnten das LysG2-NLS und das LysG2-EDS-NLS erfolgreich synthetisiert und charakterisiert werden(siehe Abbildung 48). In den anschließenden Untersuchungen wurden beide Dendrimere hinsichtlich ihrer Kondensationsfähigkeit und Transfektionsfähigkeit analysiert. Beide Vektoren wiesen die Fähigkeit auf, DNA zu kondensieren und Partikel zu bilden, wobei die Größe der Partikel mit der Konzentration der Vektoren variierte. Bei den Transfektionsexperimenten mit LysG2-NLS wurde eine geringe Transfektion der HeLa-Zellen bei einer Konzentration von 100 µM festgestellt. Die Einführung des NLS-Linkers führte nicht zu einer signifikanten Verbesserung der Transfektionseffizienz. Bei LysG2-EDS-NLS wurde keine erfolgreiche Transfektion beobachtet. Zudem führte die Zugabe dieses Vektors zu erheblichen Beeinträchtigungen der Zellviabilität, was durch die stark erhöhte Anzahl an positiven Ladungen erklärt werden kann. Die Auswertung der mikroskopischen Aufnahmen deutete auf Zellschädigungen und Apoptose hin. Toxizitätsassays bestätigten die schlechte Zellviabilität bei steigenden Konzentrationen von LysG2-NLS und zeigten eine höhere Toxizität von LysG2-EDS-NLS, insbesondere bei niedrigen Konzentrationen. Die Zellmorphologie deutete auf Zellschrumpfung und abgerundete Zellkörper hin, beides Anzeichen für Zellschädigung. Ein weiterer Ansatz war die Entwicklung des spaltbaren Vektors LysG2-Red, der durch die Einführung reduktionslabiler Disulfidbindungen die DNA effizient kondensieren und im Zellinneren freisetzen sollte. Die Synthese des LysG2-Red wurde erfolgreich durchgeführt und die Fähigkeit zur DNA-Kondensation wurde mittels DLS und Zeta-Potenzial-Messungen bestätigt. Die Transfektionsexperimente mit LysG2-Red an HeLa-Zellen ergaben jedoch keine erfolgreiche Übertragung des genetischen Materials (siehe Abbildung 49). Trotz vielversprechender Fähigkeiten zur DNA-Kondensation und der Umwandlung in positiv geladene Komplexe, zeigte der Vektor keine Transfektion des genetischen Materials in die Zellen. Die Annahme, dass die Einführung der Disulfidbrücke die Freisetzung der DNA im Zellinneren erleichtern würde, wurde nicht bestätigt. Um die Ursachen für die mangelnde Effizienz zu verstehen, wurde der Transfektionsmechanismus im weiteren Verlauf dieser Doktorarbeit genauer untersucht. Der Einsatz von Fluorophoren in Vektorsystemen ermöglicht die Verfolgung und Untersuchung der Transfektion auf zellulärer Ebene. Diese Herangehensweise verspricht, wichtige Einblicke in die Interaktionen zwischen dem Transfektionsvektor und den Zielzellen zu liefern. Zunächst wurde das vielversprechende Fluorophor Resveratron als Fluoreszenzmarker verwendet. Zu Beginn wurde die Totalsynthese des iso-Resveratronazids 46 durch eine Epoxid-Olefinierung erfolgreich durchgeführt. Danach wurde die „Click-Fähigkeit“ des iso-Resveratronazids 46 nachgewiesen. Hierfür wurde ein weniger komplexes und anspruchsvolles Alkin (Phenyl-iso-Resveratron 49) ausgewählt. Die Eignung von iso-Resveratronazid 46 für Anwendungen in der "Click"-Reaktion wurden somit nachgewiesen und die Reaktionsfähigkeit des Azidmoleküls mit anderen Verbindungen wurde belegt. Zusätzlich konnte eine erfolgreiche„Click“-Reaktion mit dem Kohlenhydrat Lactose (Lactose-iso-Resveratron 54) nachgewiesen werden (siehe Abbildung 50). Nachdem die „Click“-Fähigkeit des iso-Resveratronazids 46 nachgewiesen wurde, lag der Fokus auf der Verknüpfung des LysG2-Dendrimers, um das iso-Resveratronazid 46 als Fluoreszenzmarker nutzen zu können. Hierfür wurde versucht, das LysG2-Alkin 55 mit dem iso-Resveratronazid 46 über eine „Click“-Reaktion zu verknüpfen. as gewünschte Produkt LysG2-isoRes konnte jedoch nicht erfolgreich synthetisiert werden. Aufgrund der erfolglosen Verknüpfung mit dem verwendeten Fluoreszenzmarker Resveratron,wurden darauffolgend alternative Fluorophore untersucht. Als Fluoreszenzmarker wurde dann das Fluorophor Fluorescein analysiert. Die Synthese des Fluoresceins mit dem LysG2-Dendrimer wurde durchgeführt, dabei konnte jedoch das gewünschte Produkt nicht erfolgreich hergestellt werden. Aufgrund dieser fehlgeschlagenen Verknüpfung des Fluoresceins mit dem LysG2-Dendrimer, wurde ein weiterer Fluorophor untersucht. Als alternativer Fluorophor wurde das Rhodamin B als Fluoreszenzmarker untersucht. Die Synthese des Vektors LysG2-Rhd, bestehend aus dem Lysin-Dendrimer LysG2 und dem Fluorophor Rhodamin B, wurde erfolgreich durchgeführt (siehe Abbildung 51). Es wurden Untersuchungen durchgeführt, in denen nachgewiesen wurde, dass LysG2-Rhd die Fähigkeit besitzt, DNA zu binden und die negativ geladene DNA effektiv in positiv geladene DNA/Vektor-Komplexe zu kondensieren. Zusätzlich wurde die Morphologie der DNA/Vektor-Komplexe mithilfe einer AFM-Messung untersucht. Dabei wurde bestätigt, dass zunächst große Aggregate(1000 nm) gebildet wurden und bei weiterer Zugabe des Vektors, die DNA in kleine positiv geladene Komplexe kondensierte. Bei nachfolgenden Transfektionsexperimenten an HeLa-Zellen, konnte eine erfolgreiche Gentransfektion des mit Rhodamin B markierten LysG2-Dendrimers beobachtet werden. In weiteren Zellexperimenten wurde die Transfektionseffizienz von LysG2-Rhd in HeLa-Zellen systematisch optimiert. Dabei wurden verschiedene Parameter, wie die Konzentration des Vektors, die Menge an Plasmid-DNA und die Vorinkubationszeit variiert. Die optimalen Bedingungen für die höchste Transfektionseffizienz lagen bei einer LysG2-Rhd-Konzentration von 15 μM, 1 μg Plasmid-DNA H2B-GFP und einer Vorinkubationszeit von 15 Minuten vor. Die Untersuchungen zur Co-Lokalisierung des LysG2-Rhd im Zellinneren ermöglichten den Weg des Vektors nach der Transfektion und die Charakterisierung seiner Wechselwirkungen mit zellulären Komponenten zu verstehen. Auf diese Weise konnten mehrere Mechanismen der Transfektionsprozesse verfolgt werden. Die Aufnahmen der konfokalen Mikroskopie zeigten eine teilweise Co-Lokalisierung des Vektors und der Lysosomen. Dies beweist, dass der DNA/Vektor-Komplex durch Endozytose aufgenommen wird und anschließend entweder im Endosom freigesetzt oder im Lysosom abgebaut wird. Für eine detaillierte Untersuchung des Transfektionsmechanismus wurden HeLa-Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden nach der Transfektion mittels Live-Cell-Mikroskopie kontinuierlich überwacht. Mithilfe der Live-Cell-Mikroskopie konnte eine schnelle Aufnahme der DNA/Vektor-Komplexe, bereits 0.5 Stunden nach der Transfektion der Zellen, beobachtet werden. 3D-Aufnahmen der HeLa-Zellen ermöglichten zusätzlich die detaillierte räumliche Analyse der Verteilung des LysG2-Rhd nach der Transfektion der Zellen. Die 3D-Aufnahmen zeigten, dass das LysG2-Rhd in vesikelartigen Strukturen im Zytoplasma der Zellen lokalisiert ist. Diese vesikelartigen Strukturen könnten auf verschiedene intrazelluläre Transportmechanismen und Aufnahmeprozesse, die während der Aufnahme des Vektors in die Zellen auftreten, hinweisen.Die Mikroskopie-Aufnahmen der Transfektionsexperimente zeigten, dass nur Zellen, die kürzlich eine Mitose durchlaufen hatten, eine H2B-GFP-Fluoreszenz aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die DNA während der Mitose in den Zellkern eintritt. Der MTS-Assay zur Zelltoxizität zeigte, dass das LysG2-Rhd zwar toxischer als das LysG2 ist, aber eine ausreichende Zellviabilität bei den Transfektionskonzentrationen aufweist. Mit dem Einsatz von Rhodamin B als Fluoreszenzmarker konnte die Transfektion auf zellulärer Ebene verfolgt werden. Zusammenfassend ermöglicht die Verwendung von LysG2-Rhd nicht nur die effiziente Übertragung von genetischem Material, sondern auch die Visualisierung des Transfektionsverlaufs. Die gewonnenen Erkenntnisse tragen dazu bei, die Effizienz von LysG2-Rhd als Transfektionsvektor besser zu verstehen und liefern entscheidende Informationen für die Weiterentwicklung von Transfektionsmethoden und potenziellen Anwendungen in den Bereichen Medizin und der biologischen Forschung.

English. This section summarizes the results of this Ph.D. thesis. The present thesis focuses on the development and investigation of lysine dendrimers composed of GCP-binding units. These were examined as potential vectors for use in gene transfection and the clarification of the mechanism. The aim of this thesis was to develop a new peptidic dendrimer carrying the GCP-binding motif established by the research group of SCHMUCK. The transfection vectors were designed to consist of three main components: the scaffold (lysines), the binding unit (GCP-Lys-Phe), and the functional units (NLS, EDS-NLS, disulfide, resveratrone, fluoresceine, rhodamine B). In the first part of this thesis, the construction of the GCP-binding unit was carried out. This began with linking the GCP-binding motif with the natural amino acids lysine and phenylalanine to generate the binding unit GCP-Lys-Phe. This served as an essential binding site for the DNA. Subsequently, the focus was on the development of the basic scaffolds in order to determine the size, branching and degree of branching of the dendrimers. The scaffold was created by linking multiple lysines, resulting in successfully synthesized two-arm (Gen. 1), four-arm (Gen. 2), and eight-arm (Gen. 3) lysine dendrimers, each connected with the GCP-binding unit. The synthesized and characterized dendrimers of Gen. 1 (LysG1), Gen. 2 (LysG2), and Gen. 3 (LysG3) laid the foundation for further investigations (see Figure 52). The condensation ability of the vectors LysG1, LysG2, and LysG3 for the formation of DNA/vector complexes was characterized. The results of the DLS measurements demonstrated that the vectors are capable of condensing the negatively charged DNA, achieving optimal sizes for biological applications. Zeta potential measurements revealed a concentration-dependent neutralization of the negative charge of ctDNA by the addition of positively charged vectors. The trend showed, that with an increasing number of positive charges on a vector, the neutralization of DNA was faster. These studies confirm the vectors' ability to effectively bind DNA and condense it into positively charged DNA/vector-complexes. The positively charged complexes are crucial for successfully overcoming electrostatic repulsion at the cell membrane and thus for the efficient uptake of genetic material into the target cells. This fundamental requirement constitutes an essential basis for successful gene transfer, enhancing the efficiency of gene transfection. In summary, the vectors LysG1, LysG2 and LysG3 offer promising approaches for use as transfection vectors that could enable significant advances in gene research and therapy development. To assess the ability of the vectors (LysG1, LysG2, and LysG3) as transfection vectors, transfection experiments were performed on HeLa cells using different concentrations of the vectors. The transfection experiments demonstrated that LysG2 allows efficient transfection at a concentration of 50 µM, while LysG1 and LysG3 showed no gene transfection of HeLa cells at the tested concentrations. Cell viability studies were performed on HeLa cells using the MTS assay and showed that LysG1 and LysG2 have comparable effects on cell viability. At a concentration of 50 µM, both led to a viability of approximately 50 % to 60 %, while higher concentrations resulted in increased toxicity and viability below 50 %. In contrast, LysG3, with eight binding units and thus 16 positive charges, already showed a viability of less than 50 % at a low concentration of 10 µM. With increasing concentration, cell viability decreased further, and at higher concentrations a drastic decrease to 10 % was observed, indicating a strong toxicity towards HeLa cells. The results indicate that the toxicity of the investigated vectors depends on the number of binding units. Overall, the experiments highlight that LysG3 has a significantly higher toxicity towards HeLa cells compared to LysG1 and LysG2. In conclusion, LysG3 is the least suitable for use as a transfection vector due to its high positive charge and the resulting cytotoxicity. Due to these properties of LysG3 and the inability to transfect HeLa cells with LysG1, these vectors were not further considered. The conducted investigations regarding the vectors' binding ability to DNA, transfection efficiency on HeLa cells, and cell viability illustrate that LysG2 has the most promising properties for gene transfection. The results indicate that among the investigated vectors, LysG2 enables the most effective binding to DNA and can successfully transfer genetic material into target cells. Furthermore, LysG2 demonstrates sufficient cell viability at certain concentrations, with lower toxicity compared to other vectors such as LysG3. Due to these promising characteristics, LysG2 was considered as a promising candidate for potential applications in gene transfection. Further development of the promising four-armed LysG2 was driven by linking it to an NLS sequence, the PKKKKRKV peptide, to improve transfection efficiency. In addition, the NLS was linked to an EDS linker to influence the steric arrangement and solubility. In this process, LysG2-NLS and LysG2-EDS-NLS were successfully synthesized and characterized (see Figure 53). In the subsequent investigations, both dendrimers were analyzed for their condensation and transfection ability. Both vectors demonstrated the ability to condense DNA and form particles, with the particle size varying with the concentration of the vectors. In the transfection experiments with LysG2-NLS, a low transfection of the HeLa cells was observed at a concentration of 100 µM. The introduction of the NLS linker did not lead to a significant improvement in transfection efficiency. For LysG2-EDS-NLS, no successful transfection was observed. Moreover, the addition of this vector led to considerable impairments of cell viability, which can be explained by the greatly increased number of positive charges. The evaluation of the microscopic images indicated cell damages and apoptosis. Toxicity assays confirmed the poor cell viability at increasing concentrations of LysG2-NLS and showed higher toxicity of LysG2-EDS-NLS, especially at low concentrations. The cell morphology indicated cell shrinkage and rounded cell bodies, both signs of cell damage. Another approach involved the development of the cleavable vector, LysG2-Red, which aimed to efficiently condense the DNA by introducing reduction-labile disulfide bonds and release it inside the cell. The synthesis of LysG2-Red was successfully conducted, and its ability to condense DNA was confirmed through DLS and zeta-potential measurements. However, transfection experiments with LysG2-Red on HeLa cells did not result in the successful transfer of genetic material (see Figure 54). Despite promising capabilities for DNA condensation and conversion into positively charged complexes, the vector showed no transfection of the genetic material into the cells. The assumption that the introduction of the disulfide bridge would facilitate the release of DNA inside the cell was not confirmed. In order to understand the reasons for the lack of efficiency, the transfection mechanism was investigated in more detail in the next section of this thesis. The use of fluorophores allows tracking and investigation of transfection at the cellular level. This approach promises to provide important insights into the interactions between the transfection vector and the target cells. Initially, the promising fluorophore resveratrone was used as a fluorescence marker. At the outset, the total synthesis of iso-resveratronazide 46 was successfully achieved through an epoxide-olefination. Subsequently, the 'click' capability of iso-resveratronazide 46 was demonstrated. A less complex and less demanding alkyne (phenyl-iso-resveratrone 49) was selected for this purpose. The suitability of iso-resveratronazide 46 for applications in the 'click' reaction was thus demonstrated and the reactivity of the azide molecule with other compounds was proven. In addition, a successful 'click' reaction with the carbohydrate lactose (lactose-iso-resveratrone 54) was demonstrated (see Figure 55). After demonstrating the 'click' capability of iso-resveratronazide 46, the focus was on linking the LysG2 dendrimer to use iso-resveratronazide 46 as a fluorescence marker. For this purpose, an attempt was made to link the LysG2-alkyne 55 with the iso-resveratronazide 46 through a 'click' reaction. However, the desired product LysG2-isoRes could not be successfully synthesized. Due to the unsuccessful linking with the chosen fluorescence marker resveratrone, alternative fluorophores were subsequently investigated. The fluorophore fluoresceine was then analyzed as a fluorescence marker. The fluoresceine was synthesized with the LysG2 dendrimer, but the desired product could not be successfully obtained. Due to this unsuccessful linkage of fluoresceine with the LysG2 dendrimer, another fluorophore was investigated. As a further alternative, rhodamine B was investigated as a fluorescence marker. The synthesis of the vector LysG2-Rhd, consisting of the lysine dendrimer LysG2 and the fluorophore rhodamine B, was successfully carried out (see Figure 56). Studies were conducted demonstrating that LysG2-Rhd has the ability to bind DNA and effectively condense the negatively charged DNA into positively charged DNA/vector-complexes. Additionally, the morphology of the DNA/vector-complexes was examined using AFM measurements. It was confirmed that initially, large aggregates (1000 nm) were formed, and with the further addition of the vector, the DNA condensed into small positively charged complexes. In subsequent transfection experiments on HeLa cells, a successful gene transfection of the LysG2 dendrimer labeled with rhodamine B was observed. In further cell experiments, the transfection efficiency of LysG2-Rhd in HeLa cells was systematically optimized. Various parameters, such as the concentration of the vector, the amount of plasmid DNA and the pre-incubation time were varied. The optimal conditions for the highest transfection efficiency were at a LysG2-Rhd concentration of 15 μM, 1 μg of H2B-GFP plasmid DNA and a pre-incubation time of 15 minutes. The studies on the co-localization of LysG2-Rhd in the cell interior contributed to the understanding of the pathway of the vector after transfection and the characterization of its interactions with cellular components. This enabled the tracking of various transfection processes. The confocal microscopy images showed a partial co-localization of the vector and the lysosomes. This proves that the DNA/vector complex is taken up by endocytosis and subsequently either released in the endosome or degraded in the lysosome. For a detailed examination of the transfection mechanism, HeLa cells were continuously monitored over a 24-hour period post-transfection using live-cell microscopy. A rapid uptake of the DNA/vector complexes was observed as early as 0.5 hours after the transfection of the cells. 3D images of the HeLa cells additionally enabled a detailed spatial analysis of the distribution of LysG2-Rhd after the transfection of the cells. The 3D images revealed that LysG2-Rhd is localized in vesicle-like structures within the cytoplasm of the cells. These vesicle-like structures could indicate various intracellular transport mechanisms and uptake processes that occur during the uptake of the vector into the cells. The microscopy images of the transfection experiments revealed that only cells that had recently undergone mitosis exhibited H2B-GFP fluorescence. This indicates that the DNA enters the cell nucleus during mitosis. The MTS assay for cell toxicity indicated that while LysG2-Rhd is more toxic than LysG2, it still has sufficient cell viability at the transfection concentrations. Using rhodamine B as a fluorescence marker, the transfection could be monitored at the cellular level. In summary, the use of LysG2-Rhd not only facilitates the efficient transfer of genetic material but also enables the visualization of the transfection process. The insights gained contribute to a better understanding of the efficiency of LysG2-Rhd as a transfection vector and provide crucial information for the further development of transfection methods and potential applications in the fields of medicine and biological research.