Exploring Tumor-Associated Macrophage Heterogeneity and Their Responses to MEK Inhibition in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

English. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a highly aggressive tumor entity, which is routinely treated with gemcitabine-based chemotherapy. However, patient overall survival remains poor due to frequently occuring therapy resistance, reflecting the urgent need for identification of new treatment targets. In light of this, clinical trials started to investigate MEK inhibitors (MEKi), since the vast majority of PDAC patients harbor oncogenic KRAS mutation. Recently, PDAC tumors were molecularly stratified into two different tumor subtypes, epithelial and mesenchymal, with the latter being more aggressive and demonstrating worse prognosis and survival. Besides, there are emerging studies focusing not only on cell-autonomous tumor cell characteristics, but also on tumor-stroma interactions for tumor progression and therapy resistance. Tumor-associated macrophages (TAMs) are the predominant immune cell infiltrate within the highly immunosuppressive pancreatic tumor microenvironment (TME) and are involved in a multitude of pro-tumorigenic and immunosuppressive mechanisms, making them a promising target for anti-cancer therapy. Furthermore, TAMs display high heterogeneity and plasticity in terms of pro- and anti-inflammatory phenotypes upon various stimuli in the TME. Despite increasing advances made in our understanding of this disease, the effects of MEK inhibition on TAMs as well as the effects of different PDAC subtypes on macrophage phenotypes are largely unknown. This work aimed at investigating the effects of MEK inhibition on the TME of different PDAC subtypes with particular focus on macrophages and at the exploring tumor subtype-specific TAM heterogeneity. To investigate the effects of MEK inhibition on different macrophage phenotypes, pro-inflammatory M1-like, anti-inflammatory M2-like and unstimulated M0 macrophages were induced in vitro from mouse bone marrow. In vitro examination revealed no de-/ repolarization of macrophages upon MEKi treatment. Anti-inflammatory M2-like macrophages showed a higher sensitivity to MEKi, while proinflammatory M1-like macrophages were less sensitive to MEKi-induced cell death. Metabolic flux analysis revealed that MEKi reduced M2-like macrophage-associated oxidative phosphorylation, but less so in the other macrophage subsets. For the examination of tumor subtype-specific TAM heterogeneity and potential TAM phenotypespecific effects of MEKi, TAMs were induced by culturing with tumor-conditioned medium (TCM) from different epithelial (epiTAMs) or mesenchymal (mesTAMs) PDAC cells. TAM heterogeneity was analyzed on transcriptomic, metabolic and immunophenotypic levels. Following TCM stimulation, epiTAMs and mesTAMs showed metabolic adaptation with increased oxidative phosphorylation and decreased glycolytic rates, but could not be classified based on phenotypic marker expression of classical M1 and M2 macrophage marker proteins. Transcriptomic analysis of epiTAMs and mesTAMs revealed differential gene expression with epiTAMs showing enrichment of interferon-gamma.

German. Das duktale Pankreaskarzinom (PDAC) ist eine aggressive Tumorentität, welche standardmäßig chemotherapeutisch behandelt wird. Aufgrund der nahezu immer auftretenden Therapieresistenz haben PDAC-Patienten eine geringe Überlebensdauer, weshalb ein dringender Bedarf für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionsmöglichkeiten besteht. Vor diesem Hintergrund wurden MEK-Inhibitoren in klinischen Studien als potentielle Therapie-Option analysiert, da die Mehrheit der PDAC-Patienten eine onkogene KRAS-Mutation aufweist. Transkriptomisch lassen sich duktale Pankreaskarzinome in zwei unterschiedliche Tumor-Subtypen gruppieren, klassische und quasi-mesenchymale Tumoren, wobei letztere mit einer aggressiveren Tumorprogression und einer schlechteren Prognose für die betroffenen Patienten assoziiert sind. Aktuelle Strategien fokussieren sich jedoch nicht ausschließlich nur auf die Zell-autonomen Eigenschaften der Tumorzellen, sondern heben ebenfalls die Bedeutung der Tumor-Stroma Interaktion für Tumorprogression und Therapieresistenz-Bildung hervor. Innerhalb des immunsuppressiven PDAC-Mikromilieus stellen Tumor-assoziierte Makrophagen (TAMs) den Hauptanteil der Tumor-infiltrierenden Immunzellen dar. TAMs können den Tumor durch eine Vielzahl pro-tumorigener und immunsuppressiver Mechanismen unterstützen und stellen deshalb ein vielversprechendes neues Therapieziel dar. Darüber hinaus zeigen TAMs eine hohe Heterogenität und Plastizität in Bezug auf pro- und anti-inflammatorische Phänotypen als Antwort auf verschiedene Stimuli innerhalb des Tumor-Mikromilieus. Trotz eines verbesserten Verständnisses dieser malignen Erkrankung sind die Effekte von MEK-Inhibitoren auf TAMs im duktalen Pankreaskarzinom bisher unbekannt. Des Weiteren ist nicht bekannt, wie die verschiedenen Tumor-Subtypen den Phänotyp von TAMs beeinflussen. Die vorliegende Arbeit fokussiert sich deshalb auf die Untersuchung des Einflusses von MEK-Inhibitoren auf das TumorMikromilieu der unterschiedlichen Tumor-Subtypen mit speziellem Fokus auf Makrophagen, sowie auf die Untersuchung der Tumor-Subtyp spezifischen TAM-Heterogenität. Um die Effekte des MEK-Inhibitors Trametinib auf unterschiedliche Makrophagen-Phänotypen zu untersuchen, wurden pro-inflammatorische M1-ähnliche, anti-inflammatorische M2-ähnliche und unstimulierte M0 Makrophagen aus murinen Vorläuferzellen in vitro generiert. In vitro Experimente konnten zeigen, dass die MEK-Inhibition nicht zu einer Makrophagende- bzw. -repolarisierung führt. Des Weiteren zeigten anti-inflammatorische M2-ähnliche und unstimulierte M0 Makrophagen eine erhöhte Sensitivität gegenüber MEK-Inhibitor induziertem Zelltod, während pro-inflammatorische M1-ähnliche Makrophagen eine reduzierte Sensitivität aufwiesen. Metabolismus-Analysen zeigten, dass die MEK-Inhibition die oxidative Phosphorylierung von M2-ähnlichen Makrophagen reduzierte, während sie in den anderen Makrophagen-Phänotypen nur geringfügig beeinflusst wurde.