Identifikation und Charakterisierung von Genen der Tocopherol-Biosynthese aus Raps (Brassica napus L.)

Raps ist weltweit eine der bedeutendsten Ölpflanzen und stellt eine wichtige Quelle für Vitamin E dar. Als Vitamin E wird die antioxidativ wirkende Gruppe der Tocochromanole bezeichnet, welche aus acht Substanzen besteht. Man unterscheidet die zwei Untergruppen Tocopherol und Tocotrienol, die jeweils in α-, β-, γ-, und δ-Form vorkommen. Rapsöl enthält bis zu 1000 ppm Tocopherol, wobei γ-Tocopherol gefolgt von α-und δ-Tocopherol den größten Anteil ausmacht. Für die menschliche Ernährung hat α-Tocopherol die größte Bedeutung, während für die Ölstabilität γ- und δ-Tocopherol wirksamer sind. Für die Rapszüchtung ergeben sich hieraus als Ziele die Entwicklung von Rapssorten mit gesteigertem Tocopherolgehalt und mit speziellen Tocopherol-Zusammensetzungen. Bis heute konnte die Analyse des Tocopherolgehaltes mit nicht invasiven Methoden, wie der Nahinfrarot-Spektroskopie (NIRS) nicht zuverlässig realisiert werden. Darüber hinaus lässt diese Methode keine Unterscheidung der einzelnen Tocopherole zu. Die Tocopherol-Bestimmung erfolgt daher über die teure und aufwändige HPLC-Analytik. Eine effiziente Methode zur Selektion von Rapssorten würden molekulare Marker bieten. Da angenommen werden kann, dass die an der Tocopherolsynthese beteiligten Gene den Tocopherolgehalt maßgeblich bestimmen, sind diese Sequenzen geeignete Kandidaten, um über Assoziationsstudien und Haplotypenanalyse funktionelle Marker abzuleiten. Unter Kenntnis der Gene, die an der Tocopherolsynthese in A. thaliana beteiligt sind, sollten in dieser Arbeit orthologe Gene aus Raps identifiziert werden, um diese als molekulare Marker zu kartieren. Weiter sollte die Position der Gene im Rapsgenom mit bereits kartierten QTL verglichen werden. Die Untersuchung des Tocopherolgehaltes von 76 Rapsherkünften aus aktuellem Zuchtmaterial ergab eine breite Variation zwischen 198 mg/kg und 510 mg/kg. Über PCR-basierte Methoden ist es gelungen für drei der fünf direkt an der Tocopherolsynthese beteiligten Gene PDS1, APG1 und VTE4 homologe Sequenzen aus Raps zu klonieren. Die PCR-Ergebnisse und die Southern-Hybridisierungen ergaben, dass die drei Gene in unterschiedlicher Anzahl im Rapsgenom vorliegen. Für BnAPG1 konnte über PCR eine Sequenz identifiziert werden, für BnPDS1 zwei und für BnVTE4 vier Sequenzen. Die Ergebnisse der Southern-Analyse und einer EST-Datenbankrecherche weisen darauf hin, dass für BnAPG1 eine weitere Kopie im Genom vorkommt. Für BnPDS1, BnAPG1 und BnVTE4 konnte die Expression nachgewiesen werden. BnPDS1 und BnAPG1 haben eine mit den A. thaliana Genen identische Intron/Exon-Struktur, wobei sich die Intron-Längen zwischen den beiden Arten unterscheiden. Die BnVTE4 Sequenzen haben im Vergleich zu A. thaliana zwei zusätzliche Introns. Der Vergleich der aus den Leserahmen abgeleiteten Aminosäuresequenzen mit den jeweiligen A. thaliana Sequenzen ergab Homologien von 92 % (BnPDS1), 98 % (BnAPG1) und 88 % - 90 % (BnVTE4). Die Analyse der Aminosäuresequenzen ergab, dass die erwarteten Domänenstrukturen Glyoxalase-/ Dioxygenase-Superfamilie (BnPDS1) und der SAM-abhängigen Methyltransferasen (BnAPG1 und BnVTE4) vorhanden waren. Durch heterologe Expression von BnAPG1 und BnVTE4-1 in A. thaliana konnte deren angenommene Funktionen bestätigt werden. Dazu wurden die Tocopherol-Zusammesetzungen von sechs bzw. drei T1 Familien bestimmt. Für beide Gene konnte ein verändertes Tocopherolmuster in Samen von A. thaliana nachgewiesen werden. Die Expression von BnVTE4-1 führte zu einer Reduktion des γ- und δ-Tocopherol-Anteils bei gleichzeitiger Erhöhung des α-und β-Tocopherol-Anteils. Die Expression von BnAPG1 führte zu einer Erhöhung des α-Tocopherol-Anteils bei gleichzeitiger Reduktion des δ-Tocopherol-Anteils. Die Sequenz BnAPG1 konnte darüber hinaus im Abstand von 14 cM zu einem kartierten QTL für α-Tocopherol auf Chromosom N07 lokalisiert werden. In dieser Arbeit werden zum ersten Mal funktionelle Gene für die Tocopherolsynthese aus Raps beschrieben. Diese können nun verwendet werden, um eine für B. napus erstellte Kernkollektion zu untersuchen. Über Assoziationen zwischen Haplotypen und Tocopherol-Phänotypen sollen, den Tocopherolgehalt beeinflussende, Allele identifiziert werden, die als funktionelle Marker in der Züchtung eingesetzt werden können

Oilseed rape is a major crop for plant oil production and therefore an important source for vitamin E. The term vitamin E (chemically named tocochromanol) covers a group of eight antioxidants, four tocopherols and four tocotrienols. Each group harbours a α-, β-, γ- and δ-form. Rapeseed oil contains up to 1000 ppm tocopherol, with γ-tocopherol being the major component, followed by α- and δ-tocopherol. For human nutrition α-tocopherol is the most important form but for oil-stability high amounts of γ- and δ-tocopherol are needed. Thus rapeseed cultivars with increased tocopherol content or with altered seed tocopherol composition are desired. Until now there is no reliable non-invasive method available for tocopherol measurement like near-infrared spectroscopy (NIRS). Additionally this technology is not applicable to differentiate the tocopherol components. Hence the seed tocopherol content has to be determined by HPLC-analysis which is laborious and expensive. For selection, a marker-assisted strategy is supposed to be an efficient method. This work was based on the hypothesis that the genes involved in the tocopherol synthesis directly influence tocopherol composition and accumulation. They are therefore promising candidates for the development of functional markers which can be used for QTL mapping and association studies. In this study, the sequence information of known tocopherol genes from A. thaliana was used to clone and characterize putatively orthologous genes from B. napus. Furthermore the B. napus sequences were mapped and compared to previously mapped QTL. A panel of 76 rapeseed varieties was analyzed for their tocopherol content. A broad variation ranging from 198 mg/kg to 510 mg/kg seed tocopherol was found. PCR-based methods have been successfully used to clone homologous sequences of PDS1, APG1 and VTE4 from B. napus. The PCR-results and the Southern analysis showed that the three genes have different copy numbers in the B. napus genome. The copy numbers determined by PCR, for BnAPG1, BnPDS1 and BnVTE4 were one, two and four copies, respectively. Southern as well as EST analysis indicated the existence of one more copy for BnAPG1. For each of the B. napus tocopherol genes identified, the expression could be demonstrated. The comparison with the A. thaliana sequences showed in principal the same intron/exon structure for BnPDS1 and BnAPG1, whereas the BnVTE4 sequences contain two additional introns. The putative amino acid sequences showed 92 % (BnPDS1), 98 % (BnAPG1) and 88 % - 90 % homology to the respective A. thaliana sequences. The analysis of the amino acid sequences revealed the expected domain structures, which are a glyoxylase-/dioxygenase-superfamily domain for BnPDS1 and SAM-dependent methyltransferase domains for BnAPG1 and BnVTE4. The expected function of these genes was proven by heterologous expression of BnVTE4-1 and BnAPG1 in A. thaliana. The BnVTE4-1 and BnAPG1 were transformed into A. thaliana using an A. tumefaciens mediated root transformation method. Seeds were harvested from three BnVTE4-1 T0 plants and from six BnAPG1 T0 plants, representing nine independent transformation events. The tocopherol composition was determined by HPLC-analysis with seeds harvest from T0-Plants (T1 generation). . Both genes led to an altered tocopherol composition in A. thaliana seeds. BnVTE4-1 caused an increase in the α-tocopherol fraction with a simultaneous decrease in the γ-tocopherol fraction. BnAPG1 led to higher amounts of α-tocopherol and lower δ-tocopherol contents. Using a previously described mapping population where tocopherol QTL had been mapped, the map position of the BnAPG1 was determined. As a result, the BnAPG1 gene had been mapped to chromosome N07, 14 cM above a previously mapped QTL for α-tocopherol.