Cuantificación de coliformes fecales en extractos de moluscos bivalvos usando el gen LacZ | Quanti?cation of fecal coliforms in bivalves extracts using the LacZ gene

Algunas áreas de cultivo de moluscos bivalvos están expuestas a la contaminación de aguas residuales, lo que puede producir la concentración de bacterias conocidas como coliformes fecales. Escherichia coli es la bacteria representativa de este grupo y, cuando está en concentraciones altas, es la causa principal de enfermedades gastrointestinales al consumidor. Por lo que es importante conocer la concentración de estas bacterias en los moluscos bivalvos antes de su consumo. El método convencional para la detección de coliformes fecales es el número más probable (NMP), el cual, actualmente se basa en ensayos bioquímicos del producto del gen LacZ. Estos ensayos tardan en producir resultados hasta las 48 h. Por lo tanto, la utilización de la técnica molecular de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o en tiempo real (qPCR) puede ser una alternativa en la disminución del tiempo para procesar una muestra entre 6-8 h. En este estudio se propone un protocolo para la cuanti?cación de coliformes fecales en moluscos bivalvos utilizando el gen LacZ por qPCR que pudiera ayudar a la cuanti?cación. Para ello se utilizó la cepa de E. coli Top10 y se probaron dos condiciones del material genético y dos reporteros para la qPCR. La primer condición fue: DNA de E. coli obtenido a través de un proceso de extracción y puri?cación con un kit comercial. La otra condición fue mediante la liberación del material genético de E. coli por el método de lisis celular térmica (MLCT) de la muestra de homogenado de ostion (HO) a analizar sin extracción ni puri?cación del DNA. El ?uorocromo SYBR Green y una sonda de hidrólisis especí?ca del gen LacZ se usaron como reporteros. Tanto el DNA de E. coli como el MLCT dieron resultados positivos en la ampli?cación al agregarlos directamente al HO. Debido a que el proceso de extracción de DNA no es 100 % e?ciente, se decidió utilizar el MLCT para obtener las curvas estándar con los reporteros. El SYBR Green tuvo como límite de detección 48,000 cel·reacción-1, valor muy por arriba de los límites deseados de detección de 200 cel·reacción-1. Mientras tanto la sonda de hidrólisis con MLCT se lograron detectar muestras hasta 124 cel·reacción-1. Se considera que este procedimiento tiene potencial para su uso en la detección rápida de coliformes fecales en moluscos bivalvos.

Some areas of cultivation of bivalve mollusks are exposed to sewage pollution, which can lead to the concentration of bacteria known as fecal coliforms. The Escherichia coli bacterium is representative of this group and, when in high concentrations, is the major cause of gastrointestinal diseases to the consumer. So it is important to know the concentration of this bacterium in bivalve mollusks before consumption. The conventional method for the detection of fecal coliforms is the most probable number (MPN), which is based on biochemical assays of the LacZ gene product. This tests takes more than 48 h to produce results. Therefore, using the molecular technique quantitative polymerase chain reaction, qPCR (sometimes called real-time PCR) can be an alternative in reducing the required time down to 6-8 h. In this study, a protocol for the quanti?cation of fecal coliforms in bivalves using the gene LacZ for qPCR was developed. For E. coli Top10, two conditions of genetic material and two reporters were tested for qPCR. The ?rst condition was: DNA of E. coli obtained through a process of extraction and puri?cation with a commercial kit. The other condition was by releasing the genetic material of E. coli by the method of thermal cell lysis (MLCT) without extraction or puri?cation of DNA. The ?uorochrome SYBR Green and a speci?c hydrolysis probe for the LacZ gene were used as reporters. Both the DNA of E. coli and the MLCT gave positive results in ampli?cation when added directly to an oyster homogenate (HO). Because the DNA extraction process is not 100 % ef?cient, it was decided to use the MLCT for standard curves with reporters. The SYBR Green has detection limit of 48,000 cel·reaction-1, value well above the desired detection limits of 200 cel·reaction-1. Meanwhile the hydrolysis probe with MLCT was able to detect samples with 124 cel·reaction-1. It is considered that this method has potential to be used in the rapid detection of fecal coliforms in bivalves.