Influenza virus RNA-polymerase and its interactions with chromatin | L'ARN-polymérase des virus influenza et ses interactions avec la chromatine

English. The general goal of this PhD work was to better understand the mechanisms of the RNA-polymerase of Influenza viruses (FluPol), which carries on transcription and replication of the viral genome in the nucleus of host cells. Since Influenza viruses are not capable of synthesizing a cap, they use the ones of cellular capped mRNAs to prime viral transcription by a mechanism referred to as cap-snatching. Thus, FluPol binds to the cap of a cellular mRNA and cleaves it 10-15 nucleotides downstream to generate the primer allowing the transcription of genomic RNA into viral mRNA. Moreover, it was shown that FluPol interacts with the unstructured domain of the cellular RNA-polymerase II (Pol II) composed of 52 repeats of a motif. Phosphorylation on the serine 5 of this motif, a sign of the cellular transcription initiation, appears to be a prerequisite to the FluPol – Pol II interaction. In all likelihood, this interaction allows FluPol to be in the vicinity of cellular mRNAs cap. The first goal of this thesis work was to identify other interactions between FluPol and Pol II potentially involved in cap-snatching. An interaction between the N-terminal domain of the PB2 subunit of FluPol and the RPB4 subunit of Pol II was identified. This interaction is conserved among types A, B and C IVs. In another section, this work also uncovered by high-throughput sequencing that FluPol binds to Pol II all the way through transcription and not just during the initiation stage. These experiments also brought out that FluPol targeted innate immune response genes, participating in host shut-off. Finally, in order to better understand FluPol’s working, two types of nanoligands (VHH and artificial proteins) specific to FluPol were selected. One VHH happened to efficiently block the enzymatic activity of FluPol and recognize the PA and PB1 subunits of FluPol. Eventually, these novel tools could help elucidate the dynamic of molecular mechanisms associated with viral transcription and replication by characterizing the altered functions of FluPol and the targeted regions at an atomic scale.

French. L’objectif général de ce travail de thèse a été de mieux comprendre le fonctionnement de l’ARN-polymérase des virus Influenza (FluPol) qui assure transcription et réplication du génome viral dans le noyau de la cellule hôte. Les virus influenza ne disposant pas de la capacité à synthétiser une coiffe à l’extrémité 5’ des ARNm viraux, ils utilisent les ARNm cellulaires coiffés pour amorcer la transcription virale par un mécanisme appelé vol de coiffe. Ainsi, FluPol se fixe sur la coiffe d’un ARNm cellulaire pour le cliver 10-15 nucléotides en aval et générer l’amorce permettant de transcrire l’ARN génomique en ARNm. Par ailleurs, FluPol interagit avec le domaine non structuré de l’ARN-polymérase II cellulaire (Pol II) constitué de 52 répétitions du motif YSPTSPS. La phosphorylation de la sérine5 de ce motif, marque de l’initiation de la transcription cellulaire, apparait être un prérequis à l’interaction FluPol - Pol II. Cette interaction permet vraisemblablement à FluPol de cibler les étapes d’initiation de la transcription. Le premier objectif de ce travail de thèse a été d’identifier des interactions additionnelles entre FluPol et Pol II potentiellement impliquées dans le vol de coiffe. Une interaction entre le domaine N-terminal de lasous-unité PB2 de FluPol et la sous-unité RPB4 de Pol II a ainsi été identifiée. Cette interaction est conservée chez les virus de type A, B et C. Dans une seconde partie, ce travail a permis de mettre en évidence par des approches de séquençage à haut-débit que FluPol reste fixée à Pol II tout au long de la transcription cellulaire et non uniquement à son initiation. Ces approches ont également permis de mettre en évidence un ciblage préférentiel de FluPol pour les gènes ayant un rôle dans l’immunité innée, participant ainsi au contrôle de la réponse innée de l’hôte. Enfin, afin de mieux comprendre le fonctionnement de FluPol, des nanoligands de deux types (des VHH et des protéines artificielles) spécifiques de FluPol ont été sélectionnés. Un VHH s’est avéré bloquer efficacement l’activité enzymatique de FluPol et reconnaitre les sous-unités PA et PB1 de FluPol. A terme, ces nouveaux outils d’étude devraient permettre d’élucider la dynamique des mécanismes moléculaires associés à la transcription et la réplication virale par la caractérisation des fonctions altérées de FluPol et des domaines ciblés à l’échelle atomique.