Untersuchungen zur Infizierbarkeit neuronaler Stammzellen von Tgbov XV-Mäusen mit TSE-Erregern sowie zur Transplantation dieser Stammzellen ins Gehirn PrPC-defizienter Mäuse

German. Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) sind stets tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, wobei Tiere und Menschen gleichermaßen betroffen sind. Durch die Umwandlung des zellulären Prionproteins (PrPC) in die pathologische Isoform (PrPSc) entsteht ein Protein, welches aufgrund seiner Struktur nicht mehr vollständig abgebaut werden kann und sich daher vermehrt ablagert. Durch die Ansammlung des PrPSc kommt es zur Schädigung der betroffenen Zellen und letztendlich zum Zelltod. Trotz intensiver Forschung ist noch sehr wenig über den molekularen und zellulären Ablauf der Infektion bekannt. Die bisher erfolgreich mit verschiedenen TSE-Erregern, überwiegend Scrapie-Stämmen, infizierten Zelllinien stammen hauptsächlich von Nagetieren. Die TSE-Erkrankungen treten jedoch vor allem bei Rindern und Schafen auf. Für die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) existiert bisher noch keine infizierbare Zelllinie. Deshalb werden neuronale Stammzellen als neue Möglichkeit für Infektionsversuche gesehen. In der vorliegenden Arbeit wurden daher neuronale Stammzellen der transgenen Tgbov XV-Mauslinie, die nicht das murine, sondern das bovine PrPC exprimieren, verwendet. Nach erfolgreicher Kultivierung dieser Zellen in zwei verschiedenen Kultursystemen (adhärent und Neurosphären) wurden diese auf PrPC-Expression mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Das zelluläre Prionprotein ist Voraussetzung für eine mögliche Infektion. Inokuliert wurden die Zellen mit verschiedenen TSE-Erregern (murines TSE, Scrapie, BSE). Begründet durch die Hypothese, dass Zellen, welche das bovine PrPC bilden, mit BSE infizierbar sein könnten, standen Infektionsversuche mit BSE, auch mit frischem BSE-Material, im Vordergrund. Die Untersuchung einer möglichen PrPres-Bildung erfolgte mittels Dot-Blot-Analyse. Mit den zur Verfügung stehenden diagnostischen Mitteln konnte jedoch keine Infektion der neuronalen Stammzellen mit BSE- und anderen Erregern festgestellt werden. Dieses Ergebnis unterstützt die These, dass bisher unbekannte Faktoren bei der Infektion eine Rolle spielen. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit sollte deshalb das Verhalten dieser Zellen im lebenden, intakten Gewebeverband des Gehirns untersucht werden. Dazu wurden die kultivierten neuronalen Stammzellen mit dem pEGFP-N1-Vektor transfiziert und mittels eines stereotaktischen Instrumentes in fünf verschiedene Gehirnregionen PrPC-defizienter Mäuse transplantiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten (1, 4, 8 und in einem Fall 20 Wochen) nach der Transplantation wurden von jeder Region Gehirne auf den Verbleib der transplantierten Zellen untersucht. Deren Nachweis erfolgte über das in die Zellen eingebrachte und von diesen exprimierte GFP mittels Autofluoreszenz, die allerdings nur durch digitale Fluoreszenzmikrokopie (Keyence BZ-8000K) nachweisbar war, sowie durch den immunhistochemischen Nachweis (IHC). Die GFP-positiven Zellen mit bekannten IHC-Protokollen zu detektieren, gestaltete sich schwierig. Deshalb wurde während der vorliegenden Studie ein modifiziertes Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe der eindeutige und reproduzierbare Nachweis der GFP-enthaltenden transplantierten Zellen im Kryostatgewebeschnitt gelang. Entscheidend war die Formalinfixierung des Gehirns vor der IHC. Damit konnten zu allen Zeitpunkten, im Falle des Cortex sogar bis zur 20. Woche nach Transplantation die GFP-exprimierenden Zellen nachgewiesen werden. Auch im Stichkanal und im Ventrikelsystem waren diese Zellen detektierbar. Die transplantierten Zellen weisen im Hirngewebe für Nervenzellen typische Zellfortsätze bzw. an der Ventrikelwand die Morphologie von Ependymzellen auf. Mit Hilfe dieser Erkenntnisse und Methoden sind weitere Studien zur Infizierbarkeit dieser Zellen in Empfängermäusen mit verschiedenen TSE-Erregern möglich. Diese können für ein besseres Verständnis der zellulären Pathogenese dieser Erreger hilfreich und für die weiteren Zellkulturarbeiten in der TSE-Forschung von Nutzen sein.

English. Transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) are always fatal neurodegenerative diseases. Animals and humans are equally affected. Due to the conversion of cellular prion protein (PrPC) into the pathological isoform (PrPSc) a protein is formed, which, by its structure, can not be completely eliminated and accumulates in the cells. This accumulation of PrPSc leads to the damage of the affected cells and ultimately to cell death. Despite intensive research there is still very little known about the molecular and cellular process of infection. Cell lines, which previously infected successfully with different TSE agents, mainly scrapie strains, mostly derived from rodents. The TSE occur especially in cattle and sheep. Until now there does not exist any with BSE pathogen infected cell line. Therefore, neuronal stem cells are seen as a new opportunity for infection experiments. In the present study neuronal stem cells of the transgenic Tgbov XV mice were used, which express the bovine but not the murine PrPC. After successful cultivation of these cells in two different culture systems (adherent and neurospheres) the cells were examined for PrPC expression by western blot analysis. The cellular prion protein is a prerequisite for a possible infection. The cells were inoculated with various TSE agents (murine TSE, scrapie, BSE). Based on the hypothesis, that cells, which express the bovine PrPC, could be infected with BSE, infection experiments with BSE, also with fresh BSE agent, were preferred. The examination of a possible PrPres formation was done by dot blot analysis. With the available diagnostic tools no infection of the neuronal stem cells could be found, also not with BSE agents. This result supports the thesis that there are probably additional unknown factors playing a role in infection. Therefore in the course of this study the behaviour of these cells in living, intact tissue structure of the brain was examined. For this purpose, the cultured neuronal stem cells were transfected with pEGFP-N1 vector and transplanted by means of a stereotactic instrument in five different brain regions of PrPC knock out mice. At different time points (1, 4, 8 and in one case 20 weeks) after transplantation brains of each region were investigated for study the fate of the transplanted cells. These cells were identified via expressed GFP by use its autofluorescence and immunohistochemistry. The GFP autofluorescence could only proved by digital fluorescence microscopy (Keyence BZ-8000K). Using common protocols for immunohistochemistry the cells could not be detected in a good quality. Therefore a modified protocol was developed during the present study. With its help the clear and reproducible detection of GFP-containing cells in frozen tissue sections succeeded. The fixation of the brain in formalin before starting with immunohistochemistry was the deciding factor. The transplanted cells could be found at all time points, in the case of the cortex up to the 20th week after transplantation. They were also detected in the needle tract and the ventricular system. The morphology of the transplanted cells in brain tissue looks like neurocytes with typical cytoplasmatic processes of cell and in the ventricular system like ependymal cells. Further studies on susceptibility for infection of these neuronal stem cells in recipient mice with different TSE agents are possible considering the described methods and results. They may lead to a better understanding of the cellular pathogenesis of TSE pathogens and may be useful for future cell culture work in TSE research.