Erreger-Wirts-Interaktionen in der Dickdarmschleimhaut von Schweinen mit experimentell induzierter Schweinedysenterie | Pathogen-host-interactions in the large intestinal mucosa of pigs with experimentally induced swine dysentery

German. Schweine mit experimentell induzierter Schweinedysenterie können unter definierten Versuchsbedingungen innerhalb von wenigen Tagen nach der Inokulation mit Brachyspira (B.) hyodysenteriae zunächst schweren Durchfall mit Schleim und Blutbeimengung sowie eine fibrinös diphtheroide Kolitis entwickeln und nach Tagen bis zu mehreren Wochen spontan gesunden. Ziel der Untersuchungen war, die zellulären Vorgänge in der Dickdarmschleimhaut während der akuten Erkrankungsphase zu charakterisieren, um hieraus Einblick in die Erreger-Wirts-Interaktion zu gewinnen. Die Mehrfachfluoreszenzmethode wurde in der vorliegenden Arbeit zur Darstellung der Entzündungs- und Immunzellen in der Kolonschleimhaut des Schweines adaptiert. Mit dieser Methode wurden zunächst Vergleichsdaten zur Menge und Verteilung von Entzündungs- und Immunzellen in der Schleimhaut an vier repräsentativen Lokalisationen entlang des Dickdarms (Zäkum, proximales Kolon, Ansa centralis und Colon descendens) bei klinisch gesunden Schweinen ermittelt. Anschließend wurden die zellulären Reaktionen in der veränderten Dickdarmschleimhaut während der akuten Krankheitsphase der Schweinedysenterie charakterisiert. Mehrfachimmunfluoreszenzmarkierungen wurden etabliert für die Kombinationen von MHCII, CD16 und B. hyodysenteriae, sowie CD4, CD8 und B. hyodysenteriae. Hierdurch konnten Granulozyten, dendritische Zellen, CD4+, CD8+ und CD4+CD8+ T-Lymphozyten unterschieden werden. Makrophagen und IgA+ Plasmazellen wurden jeweils in Kombination mit B. hyodysenteriae markiert. Diese Methode wurde angewendet, da sich beim Schwein viele Zelltypen nur durch die kombinierte Darstellung von Epitopen auf den Zellen eindeutig identifizieren lassen. Die Pixel basierte Auswertung erfolgte mit dem Bildanalyseprogramm ImageJ. Durch einen rechnerischen Vergleich konnten hierbei zufällige Überlagerungen von tatsächlichen Kolokalisationen der Epitope auf den Zellen unterschieden werden. Bei den Kontrolltieren traten nur geringfügige Unterschiede in den Gesamtmengen der jeweiligen Zelltypen zwischen den Dickdarmlokalisationen auf. Es konnten aber signifikant unterschiedliche Verteilungen zwischen basalen und apikalen Schleimhautanteilen in allen vier Dickdarmlokalisationen ermittelt werden: apikal waren signifikant mehr intraepitheliale CD8+ T-Lymphozyten und basal signifikant mehr IgA+ Plasmazellen zu finden. Dies entspricht der differenzierten Verteilung dieser Zellen in Zotten und Krypten im Dünndarm. Weiterhin überwog die Menge an Granulozyten und Makrophagen im basalen Anteil der Schleimhaut des Zäkums, sowie die Menge an CD4+ T-Lymphozyten und CD4+CD8+ T-Lymphozyten im basalen Anteil der Schleimhaut des proximalen Kolons. Dagegen waren im apikalen Schleimhautbereich des Colon descendens mehr Makrophagen, dendritische Zellen, CD4+ T-Lymphozyten und CD4+CD8+ T-Lymphozyten vorhanden. Bei den Schweinen mit experimentell induzierter Schweinedysenterie wurde die Menge und Verteilung der Entzündungs- und Immunzellen gezielt in Schleimhautbereichen mit diphtheroider Kolitis im proximalen Kolon ermittelt. Die zelluläre Reaktion war durch die Zunahme der Granulozyten im apikalen Anteil der Schleimhaut, der am schwersten verändert war, charakterisiert. Die Gesamtmenge der Makrophagen und dendritischen Zellen in der Schleimhaut war geringer und ihre Verteilung hatte sich verändert. Große, teils zerfallene Makrophagen lagen in der nekrotischen Mukosa. Dendritische Zellen fanden sich besonders in der Nähe der Granulozyten und von B. hyodysenteriae. Makrophagen und dendritische Zellen demarkierten die Bereiche mit nekrotischer Schleimhaut. Viele Erreger waren in die nekrotische Schleimhaut invadiert und es waren häufig Überlagerungen des Erregers mit Granulozyten und Makrophagen zu beobachten. Dies spricht für eine Aufnahme der Bakterien oder bakterieller Antigene durch diese Zellen. Die Menge an CD4+ T-Lymphozyten und intraepithelialen CD8+ T-Lymphozyten, den Effektorzellen der T-zellvermittelten Immunantwort, war hochgradig verringert, während Anzahl und Verteilung der IgA+ Plasmazellen und die Markierung der basalen Kryptepithelzellen für IgA unverändert war. Die hier etablierten Methoden und Befunde sollen als Basis für weiterführende Untersuchungen zu Mengen und Verteilungen der Entzündungs- und Immunzellen in der Dickdarmschleimhaut bei Tieren mit experimentell induzierter Schweinedysenterie dienen. Sie können insbesondere vergleichend für die Reaktionen während der Abheilung, auf Inokulation mit unterschiedlich virulenten B.-hyodysenteriae-Stämmen und nach Impfung und Challenge-Infektion genutzt werden.

English. Pigs with experimentally induced swine dysentery may develop severe diarrhea with mucus and blood and fibrinous to diphtheroid colitis a few days after inoculation with Brachyspira hyodysenteriae and recover spontaneously after a few days to several weeks. The objective of this investigation was to characterize the cellular reactions in the large intestinal mucosa during the acute disease to gain insights into pathogen-host interactions. The multiple immune fluorescence method was adapted to differentiate inflammatory and immune cells in the colonic mucosa of the pig. Using this method, quantity and distribution of inflammatory and immune cells was first compared in the mucosa at four representative localizations along the large intestine (cecum, proximal colon, central flexure, descending colon) of clinically healthy pigs. Then the cellular reactions were characterized in the altered large intestinal mucosa during the acute phase of swine dysentery. Multiple immune fluorescence protocols were established for the combination of MHCII, CD16 and Brachyspira hyodysenteriae as well as CD4, CD8 and Brachyspira hyodysenteriae. This allowed to differentiate granulocytes, dendritic cells, CD4+, CD8+ and CD4+CD8+ T-lymphocytes. Macrophages and IgA+ plasma cells each were labeled in combination with Brachyspira hyodysenteriae. This method was used, because many cell types in pigs can be conclusively identified by the combined labeling of epitopes on the cells only and because it allowed to study the interaction of Brachyspira hyodysenteriae with the various cell types. Data analysis was pixel based using the image analysis program ImageJ. Accidental and real co-localizations of epitopes on cells were distinguished by mathematical comparison. In the control pigs, the quantity of the different cell types in the full thickness of the mucosa varied only minor between the large intestinal localizations examined. There were, however, significant differences between basal and apical regions of the mucosa in all four sites: the number of intraepithelial CD8+ T lymphocytes was significantly higher in the apical regions, whereas the quantity of IgA+ plasma cells was significantly higher in the basal regions. This is comparable to the distribution of these cells in villi versus crypts in the small intestine. In addition, the quantity of granulocytes and macrophages was higher in the basal region of the cecum than that of CD4+ and CD4+ CD8+ T lymphocytes in the basal region of the proximal colon. In contrast, more macrophages, dendritic cells, CD4+ and CD4+ CD8+ T lymphocytes were present in the apical region of the mucosa in the descending colon. In pigs with experimentally induced swine dysentery, quantity and distribution of inflammatory and immune cells were specifically determined at sites with diphtheroid colitis in the proximal colon. Cellular reactions were characterized by an increased number of granulocytes in the apical region of the mucosa that was most severely damaged. The overall quantity of macrophages and dendritic cells was decreased and their distribution in the mucosa had changed. Large, partly disintegrated macrophages were present in necrotic mucosa. Dendritic cells were found in close proximity to neutrophils and Brachyspira hyodysenteriae. Macrophages and dendritic cells demarcated areas of necrotic mucosa. Many Brachyspira hyodysenteriae had invaded the areas of necrotic mucosa and there was co-localisation of Brachyspira hyodysenteriae with granulocytes and macrophages suggesting uptake of bacteria or bacterial antigen by these cells. There was a marked reduction of CD4+ T lymphocytes and intraepithelial CD8+ T lymphocytes, the effectors of cellular immunity, whereas quantity and distribution of IgA+ plasma cells and labeling of basal crypt epithelial cells for IgA was unchanged. Methods and findings of this investigation will be the basis for further investigations of the quantity and distribution of inflammatory and immune cells in the large intestinal mucosa in pigs with experimentally induced swine dysentery. They may serve for comparison of reactions during recovery, after inoculation with Brachyspira hyodysenteriae strains of different virulence and after vaccination and challenge.