Lyssavirus Matrixprotein Funktionen bei der Virusmorphogenese und Wirtszellmanipulation

German. Lyssavirus Matrixproteine (M) sind essentielle Komponenten im Virus-Assembly. Zusätzliche Virus RNA-Synthese regulierende und wirtszellmanipulierende Funktionen machen das M Protein zu einem zentralen Faktor der wirtszellabhängigen Virusreplikation und Pathogenese im infizierten Organismus. Damit könnte das M Protein einen wesentlichen Faktor bei der Anpassung von Lyssaviren an bestimmte Wirtsspezies darstellen und als Pathogenitätsdeterminante die spezifische Virulenz unterschiedlicher Lyssavirus Isolate begründen. Inwieweit Lyssavirus M Proteine sich tatsächlich in grundlegenden Funktionen der Virusreplikation und Wirtszellmanipulation unterscheiden, ist bisher nur unzureichend geklärt. Hier wurden M Proteine aus einem attenuierten Rabies Virus Stamm (RABV M) und aus einem fledermausassoziierten Lyssavirus (Europäische Fledermaus Lyssavirus Typ 1; EBLV 1 M) hinsichtlich funktioneller Unterschiede im Virus-Assembly und ihrer intrazellulären Lokalisation in virusinfizierten Zellen verglichen. Zusätzlich wurde durch die gezielte Insertion von Mutationen in das RABV M Protein ein stark attenuiertes RABV generiert, das eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung M abhängiger Mechanismen der Pathogenese und Viruseliminierung aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) darstellt. Tatsächlich wurden mit chimären RABV M und EBLV 1 M exprimierenden Viren M abhängige Unterschiede in der Virusmorphogenese bestätigt. Eine RABV M abhängige Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rauen Endoplasmatischen Retikulum (rER) wurde mit der Kombination unterschiedlicher RABV und EBLV 1 M Sequenzen auf fünf C terminale Aminosäuren an den Positionen 187, 190, 192, 196 und 197 eingegrenzt. Mit der Identifizierung dieser Positionen konnte postulierte werden, dass es sich bei den beobachteten ultrastrukturellen Unterschieden nicht um Virusspezies sondern um Isolat-spezifische Unterschiede handelt, die möglicherweise einen Einfluss auf in vivo Virusreplikation und Pathogenese haben. Die vergleichende fluoreszenzmikroskopische Analyse infizierter Zellen zeigte, dass EBLV 1 M Protein im Gegensatz zum RABV M Protein an Membranen des Golgi-Apparates akkumulierte. Im Gegensatz zur Akkumulierung von Viruspartikel-ähnlichen Strukturen im rER konnte die EBLV 1 M spezifische Golgi-Apparat Lokalisation nicht auf einzelne Bereiche des M Proteins eingegrenzt werden, weshalb davon ausgegangen werden muss, dass hier die Integrität des gesamten EBLV 1 M Proteins notwendig ist. Erstmals wurden Lyssavirus M Proteine in viralen Einschlusskörpern und Zellkernen infizierter Zellen nachgewiesen. Während die Präsenz in den Einschlusskörpern ein wichtiges Element bei der Erforschung RNA-Synthese regulativer M Funktionen darstellt, können mit dem Nachweis von Lyssavirus M Proteinen im Zellkern wirtszellmanipulierende Funktionen auf nukleärer Ebene postuliert werden. Neben dem Nachweis der Proteine im Nukleus wurde mit fluoreszenzmarkiertem M Protein gezeigt, dass die Kernmembran eine Diffusionsbarriere für das M Protein darstellt und dass ein aktiver Transport in den Zellkern stattfinden muss. Zusammenfassend werden mit dieser Arbeit wichtige Erkenntnisse zu Unterschieden und Gemeinsamkeiten von Lyssavirus M Proteinen bezüglich Virusmorphogenese und wirtszellmanipulierender M Funktionen vorgelegt, die das aktuelle Verständnis der Lyssavirus Replikation vertiefen und weiterführende Arbeiten zu molekularen Mechanismen der Virusreplikation und Pathogenese ermöglichen.

English. Lyssavirus matrix proteins (M) are essential components in virus assembly. Additional functions in virus RNA synthesis regulation and host-cell manipulation make the M protein a central factor of host-cell dependent virus replication and pathogenesis in infected organisms. Thus M protein could be an important factor in adaptation of lyssaviruses to certain host species and could determine the specific virulence of different lyssavirus isolates. To what extent lyssavirus M proteins actually differ in basic functions of virus replication and host-cell manipulation is so far poorly understood. Here M proteins from an attenuated rabies virus strain (RABV M) and a bat-associated lyssavirus (European Bat Lyssavirus Type 1; EBLV 1 M) were compared for functional differences in virus assembly and their intracellular localization in virus infected cells. In addition, a highly attenuated RABV was generated by site-directed insertion of mutations into the RABV M protein, which represents an important basis for further exploration of M dependent mechanisms of pathogenesis and virus elimination from the central nervous system (CNS). In fact, M dependent differences in virus morphogenesis were confirmed with chimeric RABV M and EBLV 1 M expressing viruses. A RABV M-dependent accumulation of virus particle-like structures in the rough endoplasmic reticulum (rER) was mapped to five C terminal amino acids at positions 187, 190, 192, 196 and 197 with a combination of different RABV and EBLV 1 M sequences. The identification of these positions leads to the conclusion that the observed ultrastructural differences are not virus species specific but isolate specific differences with a potential effect on virus replication and pathogenesis in vivo. Comparative fluorescence microscopy analysis of infected cells revealed that EBLV 1 M protein in contrast to RABV M protein accumulated on membranes of the Golgi apparatus. In contrast to the accumulation of virus particle-like structures in the rER the EBLV 1 M-specific Golgi apparatus localization could not be addressed to specific regions of the M protein, and therefore it has to be concluded that the integrity of the entire EBLV 1 M protein is necessary. For the first time lyssavirus M proteins were detected in viral inclusion bodies and in nuclei of infected cells. While the presence in inclusion bodies is an important element in the study of regulatory M functions in RNA synthesis, host-cell manipulative functions on the nuclear level can be postulated from the detection of lyssavirus M proteins in the nucleus. In addition to the detection of the proteins in the nucleus, by fluorescence-labeled M proteins it was demonstrated that the nuclear membrane is a diffusion barrier for M and that active nuclear import has to take place. In summary, this study presents important insights into differences and similarities of lyssavirus M proteins with respect to virus morphogenesis and host cell manipulation, deepens the current understanding of lyssavirus replication and enables further work on molecular mechanisms of virus replication and pathogenesis.