A Whole-Genome sequencing-based study of the emergent multidrug-resistant Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis clones in German broiler farms

German. Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis) nimmt die vierte Position in der Rangliste der am häufigsten gemeldeten Salmonella-Serovare in Europa ein. Während des letzten Jahrzehnts hat das Auftreten einer multiresistenten Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis)-Population rapide zugenommen und ist in der europäischen und außereuropäischen Broilerproduktion weit verbreitet. Die Studie zielte darauf ab, i) eine bioinformatische Pipeline für die in silico-Serotypisierung von Salmonellen zu implementieren und deren Leistungsfähigkeit zu bewerten, und ii) die genetischen Determinanten für das in der deutschen Broilerproduktion während des letzten Jahrzehnts beobachtete vermehrte Auftreten von S. Infantis zu identifizieren. Zunächst wurde eine Bioinformatik-Pipeline (WGSBAC) und drei bioinformatische Tools (SISTR, SeqSero und SeqSero2) zur Genoserotypisierung von 43 Salmonella spp.-Stämmen von 26 verschiedenen Serovaren durchgeführt. Zweitens führten wir die Genomsequenzierung von 30 S. Infantis Broiler-Isolaten durch, die in zwei unterschiedlichen Jahrzehnten (den 1990er und den 2010er Jahren) gesammelt wurden. Wir setzen die WGSBAC-Pipeline und externe Bioinformatik-Software ein, um i) die Qualität der sequenzierten Reads zu bewerten und zu kontrollieren, ii) Assemblierungen und Qualitätskontrollen von und iii) Annotation, Typisierung durch klassischen MLST, cgMLST, Genoserotypisierung, phylogenetische Rekonstruktion mittels Einzelnukleotidänderungen (SNPs) und in-silico-Phänotyp-Vorhersage, einschließlich antimikrobieller Resistenzgene (AMR), Virulenzgene und Plasmid-Replikons zu erkennen. Die Bioinformatik-Pipeline WGSBAC ist geeignet, das antigene Profil der meisten der in der Studie verwendeten Salmonella-Stämme zu bestimmen. Das Tool SISTR zeigte dabei die höchste Übereinstimmung (79,1 %), gefolgt von SeqSero2 (72,1 %) und SeqSero (60,5 %). Die Untersuchung der S. Infantis-Stämme ergab, dass im Gegensatz zu den Isolaten aus den 1990er Jahren, die Mehrheit der Stämme aus den 2010er Jahren das Vorhandensein eines Megaplasmids zeigte, das homolog zu dem pESI-Plasmid aus Israel und anderen pESIähnlichen Plasmiden aus europäischen Isolaten ist. Das deutsche pESI-ähnliche Plasmid kodierte für ein Muster von multiresistenten Genen (MDR), ein Muster von Virulenzgenen und mehrere Fitness-assoziierte Determinanten, welches wir 'ESIr' nannten. Dieses korrelierte mit mindestens drei antimikrobiellen Familien: ant(3')-Ia (Aminoglykoside), sul1 (Sulfonamide) und tet(A) (Tetracycline). Der Genotyp korreliert hier vollständig mit dem antimikrobiellen Phänotyp. Außerdem bezeichneten wir das Virulenzmuster als 'ESIv', welches Gene für Fimbrien-Cluster, Yersiniabactin-Siderophore, Quecksilberresistenz und Antitoxin/Antitoxin- Systeme mit einschließt. Die Genotypisierungsanalyse ergab das Vorhandensein eines neuen Sequenztyps (ST2283) bei der Mehrzahl der Stämme aus den 2010er Jahren und ST32 und ST1032 bei den Stämmen aus den 1990er Jahren. Anhand eines auf Gesamtgenomsequenzierung-basierten Ansatzes zeigte diese Studie, dass MDR S. Infantis ST2283 Stämme, die ein pESI-ähnliches Plasmid tragen, während des letzten Jahrzehnts entstanden sind und derzeit in der deutschen Geflügelproduktionskette zirkulieren. Der Erwerb eines Megaplasmids, das für Resistenzen, Virulenz-assoziierte Determinanten und Fitnessmechanismen kodiert, könnte dieses schnelle und besorgniserregende epidemiologische Ereignis erklären. Dieses Ereignis stellt eine Gefahr für die öffentliche Gesundheit dar. Daher sind Kontrollmaßnahmen und die Unterstützung epidemiologischer Studien erforderlich, um den Eintritt, die Übertragung und die weitere Verbreitung dieser klonalen Population in der Lebensmittelkette zu verhindern.

English. Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis) places the fourth position in the ranking of most reported Salmonella serovars in Europe. During the last decade, a multi-drug resistant (MDR) S. Infantis population has rapidly increased and widespread in European and non-European broiler production. The study proposed here aimed to i) implement and evaluate the performance of a bioinformatics pipeline named WGSBAC for Salmonella in silico serotyping, and ii) identify the genetic determinants for the increased emergence of broiler-derived S. Infantis observed in Germany. First, we conducted an evaluation of WGSBAC and three bioinformatic tools (SISTR, SeqSero, and SeqSero2) for the characterization and genoserotyping of 43 Salmonella strains of 26 different serovars. Second, we performed sequencing of 30 broiler-derived S. Infantis isolates collected from two distant decades (the 1990s and the 2010s). We applied the WGSBAC pipeline and external bioinformatics software to i) assess and control the quality of the sequenced reads ii) assembly and quality control of assemblies, and iii) annotation, typing by classical MLST, cgMLST, genoserotyping, SNPs-based phylogenetic reconstruction and in silico phenotype prediction including antimicrobial resistance genes (AMR), virulence genes and plasmid replicons detection. To detect possible clonal relatedness with other S. Infantis clones from Europe, we performed a further comparative genome analysis using 17 public genomes of other S. Infantis clones circulating in Europe. WGSBAC was feasible for the serovar prediction of most of the 43 Salmonella strains. The tool SISTR reported the highest correlation (79.1%) followed by SeqSero2 (72.1%) and SeqSero (60.5%). The study of the S. Infantis strains revealed that in contrast to the isolates from the 1990s, the majority of the strains from the 2010s revealed the presence of a megaplasmid that carried a multidrug-resistant genes (MDR) pattern, a virulence genes pattern, and several fitness-associated determinants. We termed the MDR gene pattern “ESIr” and it coded for at least three antimicrobial families: ant(3”)-Ia (aminoglycosides), sul1 (sulfonamides), and tet(A) (tetracyclines). Besides, we termed the virulence pattern as “ESIv” which includes genes for fimbriae cluster, yersiniabactin siderophore, mercury resistance, and antitoxin/antitoxin systems. Furthermore, the genotyping analysis revealed the presence of a novel sequence type (ST2283) among the majority of the strains from the 2010s and ST32 and ST1032 within the strains from the 1990s. This genetic traits may promote the rapid incidence and dissemination of a novel MDR S. Infantis population. Following a WGS-based approach, this study evidences that MDR S. Infantis ST2283 strains carrying a pESI-like plasmid have emerged during the last decade and are currently circulating in the German poultry production chain. This event results in an urgent public health hazard, thus, control measures and the support of epidemiological studies are needed to prevent the entrance, transmission, and further dissemination of this clonal population in the food chain.