Diagnosis, pathogenesis and control of capripox virus-induced diseases | Diagnostik, Pathogenese und Bekämpfung von Capripockenvirus-induzierten Erkrankungen

German. Die Gattung Capripoxvirus beinhaltet das Virus der Lumpy-Skin-Krankheit (LSDV), das Schafpockenvirus (SPPV) und das Ziegenpockenvirus (GTPV), die hauptsächlich Rinder bzw. Schafe und Ziegen infizieren. Während LSDV vorwiegend mechanisch über blutsaugende Vektoren und möglicherweise über Schildzecken übertragen wird, sind der direkte Kontakt sowie die Aerosoltransmission als Hauptübertragungsrouten für SPPV und GTPV beschrieben. Betroffene Tiere entwickeln Fieber und zeigen klinische Anzeichen wie z.B. okularen und nasalen Ausfluss, Lymphadenopathie und charakteristische Hautläsionen. Schwere Krankheitsverläufe, insbesondere in Verbindung mit respiratorischen Symptomen, können für die infizierten Tiere zum Tod führen. In endemischen Gebieten ist die Mortalität Capripockenvirus-induzierter Erkrankungen relativ gering (1-10%). In exotischen Rassen oder in Tieren, die auf Hochleistung (zum Beispiel Milch- oder Fleischrassen) gezüchtet wurden, kann die Mortalität von LSDV bis zu 75% und die Mortalität von SPPV und GTPV bis zu 100% betragen. Der aus den Hautläsionen resultierende Qualitätsverlust des Leders, reduzierte Gewichtszunahme und reduzierte Milchleistung sowie der Verlust betroffener Tiere führen zu Umsatzeinbußen und beeinflussen dadurch sowohl die nationale als auch die globale Wirtschaft. Dadurch haben Capripockenvirus-induzierte Erkrankungen nicht nur einen erheblichen Einfluss auf das infizierte Einzeltier, sondern auch auf kleine Familienunternehmen und landwirtschaftliche Großbetriebe. Derzeit sind zur Prophylaxe lediglich attenuierte Lebendvakzinen kommerziell erhältlich. Diese sind in der Europäischen Union jedoch nicht zugelassen, da ihr Einsatz den Verlust des Status „Capripocken-frei“ für das jeweilige Land bedeutet. Aus diesen Gründen werden dringend sowohl zuverlässige und zeitsparende Diagnostikmethoden für die Detektion und Charakterisierung von Capripocken, als auch sichere und effiziente Kontrollmaßnahmen benötigt. Ziele dieser Arbeit waren die Entwicklung, Validierung und vergleichende Analyse verschiedener diagnostischer Methoden, die Durchführung von Pathogenesestudien zur Etablierung von Infektionsmodellen für alle drei Capripockenviren und die Entwicklung und Testung verschiedener inaktivierter Prototypvakzinen gegen das LSDV. Im Laufe dieser Arbeit wurden neue real-time quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR)-Assays für eine robuste Detektion und Differenzierung zwischen LSDV-Feldstämmen, LSDV-Vakzinestämmen, SPPV und GTPV entwickelt und umfassend validiert. Im Anschluss wurden jeweils zwei dieser Einzelassays zu sogenannten Duplex-Assays kombiniert. Der erste Duplex-Assay ist in der Lage, zwischen LSDV-Feldstämmen und LSDV-Vakzinestämmen zu unterschieden, der zweite Duplex-Assay erlaubt die Differenzierung zwischen SPPV und GTPV. Schließlich wurde ein diagnostischer Workflow basierend auf den beiden neuen Duplex-Assays in Kombination mit bereits publizierten Methoden etabliert. Dieser ermöglicht eine zeitsparende, robuste und zuverlässige Detektion, Spezies-spezifische Identifizierung und genetische sowie phylogenetische Charakterisierung der drei Capripockenvirusspezies. Zudem wurden bereits vorhandene serologische Diagnostikmethoden (der Serumneutralisationstest und ein kommerziell erhältlicher ELISA) hinsichtlich ihrer Sensitivität und ihrer Spezifität verglichen. Des Weiteren wurden Pathogenesestudien mit verschiedenen Capripockenvirusisolaten in der jeweiligen Zieltierart durchgeführt, mit dem Ziel, geeignete Infektionsmodelle für zukünftige Vakzinestudien zu etablieren. Die Pathogenesestudien mit den Isolaten GTPV-„V/103“ und LSDV-„Macedonia2016“ zeigten, dass beide Virusisolate gute Kandidaten für Infektionsmodelle mit GTPV und LSDV darstellen. Um ein geeignetes Infektionsmodell für SPPV zu finden, war die Testung von drei verschiedenen SPPV-Isolaten (SPPV-„V/104“, SPPV-„India/2013/Surankote“ und SPPV-„Egypt/2018“) notwendig. Letztendlich stellte sich das virulente SPPV-„India/2013/Surankote“-Isolat als geeignetster Kandidat heraus. Abschließend wurden verschiedene Prototypen einer inaktivierten LSDV-Vakzine entwickelt und hinsichtlich Abwehrreaktionen und Schutzwirkung im Rind getestet. Der entwickelte Vakzinekandidat induzierte einen vollständigen klinischen Schutz in Rindern und erwies sich damit als sehr vielversprechend. Molekulare und serologische Daten weisen zudem darauf hin, dass mit dieser Prototypvakzine eine sterile Immunität in den Rindern erzielt werden konnte. Eine kommerzielle Vakzine mit diesen Eigenschaften würde einen bedeutenden Fortschritt in der Kontrolle von LSDV darstellen. Weitere Studien mit dem Ziel, die Diagnostik und Kontrolle von Capripockenviren weiter zu verbessern, sind auch in Zukunft noch notwendig. Dieses betrifft beispielsweise die Entwicklung Sonden-basierter real-time qPCR-Assays zur Unterscheidung von SPPV- und GTPV-Feld- und Vakzinestämmen, die den diagnostischen Workflow komplettieren würden. Von Bedeutung sind außerdem weiterführende Tests der inaktivierten Prototypvakzine hinsichtlich der minimalen protektiven Dosis und einer möglichen Kreuzprotektion in Schafen und Ziegen gegen SPPV und GTPV.

English. The genus Capripoxvirus of the family Poxviridae consists of the species lumpy skin disease virus, sheeppox virus and goatpox virus that affect cattle, sheep and goats, respectively. Whereas lumpy skin disease virus (LSDV) is transmitted mainly mechanically via blood-feeding insects and possibly hard ticks, the major transmission routes of sheeppox virus (SPPV) and goatpox virus (GTPV) are via direct contact and aerosols. Affected animals develop fever and display clinical signs such as ocular and nasal discharge, lymphadenopathy and characteristic lesions of the skin. Severe clinical course, especially in combination with respiratory signs, can result in the death of the affected animals. In endemic regions, mortality of capripox virus-induced diseases is low (1-10%). However, mortalities of up to 75% have been reported for LSDV and up to 100% for SPPV and GTPV in exotic breeds and high-producing dairy or beef animals. The loss of quality of the leather, reduced weight gain and milk yield as well as complete loss of affected animals have severe impact on national and global economies. Therefore, capripox virus-induced diseases have significant impact on both the affected individual animal as well as on the existence of small-scale farmers and large agricultural enterprises. However, until now, only live attenuated vaccines are commercially available. These attenuated vaccines are not authorized in the European Union and their administration would comprise the disease-free status of the respective country. Thus, reliable diagnostic tools for the detection and characterization of capripox viruses as well as safe and efficient control measures are of high importance. The objectives of the present thesis were the development, validation and comparison of diagnostic tools, the establishment of challenge infection models and the performance of pathogenesis studies for all three capripox virus species, and the development and testing of different inactivated prototype vaccine candidates against LSDV. First, new real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assays for robust detection and differentiation of LSDV field strains, LSDV vaccine strains, SPPV and GTPV were developed and extensively validated. In the following, two single assays were combined to duplex assays, one for the differentiation between LSDV field strains and LSDV vaccine strains, and the second for discrimination of SPPV and GTPV. Finally, a diagnostic workflow based on these new duplex assays in combination with already published methods was established. This workflow enables time-saving, robust and reliable detection, species-specific identification and genetic and phylogenetic characterization of all three capripox virus species. In addition, already existing serological examination methods (serum neutralization assay and commercial enzyme-linked immunosorbent assay) were compared regarding their sensitivity and specificity. Furthermore, pathogenesis studies with different capripox virus isolates were performed in the respective target species, and the suitability of selected virus isolates as challenge viruses for future vaccine studies was analyzed. Pathogenesis studies with isolates GTPV-“V/103” and LSDV-“Macedonia2016” revealed that both are proper candidates for challenge models. Finally, three different SPPV isolates (SPPV-“V/104”, SPPV-“India/2013/Surankote” and SPPV-“Egypt/2018”) were tested in sheep regarding their virulence to find a suitable challenge model for SPPV, and SPPV-“India/2013/Surankote” was chosen for future vaccine studies. Once appropriate challenge models were established, different inactivated prototype vaccines against LSDV were developed, and vaccine safety as well as vaccine efficacy were tested in cattle. Eventually, a Polygen-adjuvanted inactivated LSDV-vaccine candidate was selected that is able to fully prevent cattle from any LSDV-related clinical signs after severe challenge infection. Furthermore, molecular and serological data indicate that this inactivated prototype vaccine is even able to induce a kind of “sterile immunity” against LSDV in those cattle. It has to be mentioned that a commercially available vaccine similar to this prototype vaccine would be a great advance for the control of LSDV. In the future, additional studies addressing diagnostics and optimized control of capripox viruses should be performed. Firstly, probe-based real-time qPCR assays for the differentiation of SPPV and GTPV vaccine strains from their respective virulent field strains should be developed and included into the diagnostic workflow. Secondly, further tests of the inactivated prototype vaccine, e.g. determination of the minimum protective dose and the possibility of cross-protection in sheep and goats against SPPV and GTPV, respectively, should be performed.