Advanced light microscopy to resolve spatio-temporal and spatio-morphological infection processes in vitro and in vivo | Anwendung komplexer lichtmikroskopischer Methoden zur räumlich-zeitlichen und räumlich-strukturellen Auflösung von Infektionsprozessen in vitro und in vivo

German. Technologische Fortschritte im Bereich der Lichtmikroskopie sind schon immer mit beispiellosen Einblicken in biologische Prozesse einhergegangen. Speziell für die Mikrobiologie stellte die Lichtmikroskopie sogar eine entscheidende Schlüsselrolle bei der Konzeption der Disziplin dar. Die Möglichkeit Krankheitserreger, welche sich ansonsten der menschlichen Beobachtung entziehen würden, visuell zu studieren, macht sie gleichermaßen zu einer maßgeblichen Grundvoraussetzung und zu einem unverzichtbaren Werkzeug für die infektionsbiologische Forschung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Optimierung, der Ausbau und die funktionelle Anwendung komplexer lichtmikroskopischer Methoden, um räumlich-zeitliche sowie räumlich-strukturelle Komponenten bakterieller und viraler Infektionsprozesse in vitro und in vivo aufzuklären. Krankheitserreger sind in einem konstanten Wettrüsten mit dem Immunsystem des Wirts. Indem sie Wege finden wirtsvermittelte Immunantworten zu umgehen, sind Pathogene in der Lage ihre Eliminierung zu verhindern und dadurch ihre eigene Vermehrung zu begünstigen. In der ersten Studie (Publikation I) wurde gezeigt, dass der obligat intrazelluläre Erreger Coxiella burnetii nicht nur fähig ist natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zu infizieren, sondern tatsächlich darüber hinaus in der Lage ist den harschen degradierenden Bedingungen in den Granula dieser zytotoxischen Lymphozyten standzuhalten. Zur Unterstützung verschiedener statischer Analysen wurde die transiente NK-Zellpassage mittels Lebendzellmikroskopie reporterexprimierender Coxiella burnetii visualisiert, um so präzise Informationen zum räumlich-zeitlichen Ablauf dieses hochdynamischen Prozesses zu gewinnen. Die Freisetzung infektiöser Coxiella burnetii-Organismen konnte dabei auf ein Zeitfenster zwischen 24 und 48 Stunden nach der Infektion festgelegt werden, die Dauer dieses Prozesses auf ungefähr 15 Minuten. Das Ziel des zweiten Ansatzes dieser Arbeit (Publikationen II-V) war die Aufklärung des räumlich-strukturellen Kontextes von Virusinfektionen. Bisher basierte ein Großteil der Studien, die die Verteilung oder den Tropismus von Viren in vivo untersucht haben, auf konventioneller Immunhistochemie in Dünnschnitten. Das Weglassen der nativen räumlichen Umgebung des Infektionsherdes birgt dabei allerdings das inhärente Risiko diesen nur unzureichend zu charakterisieren. Obwohl entsprechende technische Voraussetzungen und notwendige Probenaufbereitungsprotokolle für die Aufnahme immunfluoreszenzgefärbter volumetrischer Proben seit Kurzem verfügbar sind, haben diese bisher keine tiefergehende Anwendung im virologischen Kontext gefunden. Ein integraler Bestandteil dieser Arbeit war es daher vorhandene Gewebeklärungsprotokolle zu evaluieren und optimieren, um so eine immunfluoreszenzkompatible 3D-Imaging-Pipeline zur Untersuchung von Virusinfektionen in ihrem intakten räumlich-strukturellen Kontext zu entwickeln (Publikation II). Dies stellte die Basis aller volumetrischen Analysen virusinfizierter Gewebe dar, die in dieser Arbeit im Nachfolgenden vorgestellt werden. Infolgedessen leistete diese Arbeit einen wertvollen Beitrag zu zukünftiger Virusforschung in Form eines Machbarkeitsnachweises und methodischer Blaupausen zur Aufklärung von Erreger-Wirt-Interaktionen in Gewebeproben auf mesoskopischer Ebene (Publikationen II-V). Dabei wurden das Tollwutvirus (RABV; Publikationen II-IV) und das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; Publikation V) als Infektionsmodelle für das Nervensystem sowie den Respirationstrakt verwendet. Die Anwendung und konsequente Weiterentwicklung dieses volumetrischen 3D-Imaging-Arbeitsablaufs ermöglichte im Folgenden neuartige Einblicke in den gesamten in vivo Zelltropismus von RABV im zentralen (ZNS; Publikation III) und peripheren Nervensystem (PNS; Publikation IV). So wurde im ZNS eine virusstammabhängige Infektion von Astrozyten aufgedeckt (Publikation III). Hierbei wurde mittels quantitativer Bildanalyse gezeigt, dass nur RABV-Feldvirusstämme zur nicht-abortiven Infektion von Astrozyten nach intramuskulärer Inokulation führten, obwohl sowohl pathogene Feldviren als auch labor-attenuierte RABV-Stämme in der Lage waren Neurone im ZNS zu einem vergleichbaren Maße zu infizieren. Durch die Kombination von Lichtblatt- und Konfokalmikroskopie wurden weiterhin Schwann-Zellen als relevante Zielzellpopulation pathogener Feld-RABV im PNS identifiziert (Publikation IV). Zusammengenommen deutete dies darauf hin, dass die nicht-abortive Infektion von Gliazellen in ZNS und PNS eine Schlüsselfunktion für die Tollwutpathogenese haben und somit signifikant am letalen Verlauf der Krankheit beteiligt sein könnte. Um abschließend vom vollständigen volumetrischen Potenzial der Lichtblattmikroskopie zu profitieren, wurde eine nochmals weiterentwickelte Version der etablierten 3D-Imaging-Pipeline verwendet, um eine detaillierte mesoskopische Untersuchung der Verteilung von SARS-CoV-2 im Respirationstrakt des Tiermodells Frettchen vorzunehmen (Publikation V). Insbesondere für einen neuartigen Krankheitserreger mit globaler Relevanz wie SARS-CoV-2 ist ein tiefgreifendes Verständnis der Virus-Wirt-Interaktionen entscheidend. Durch den Erhalt des vollständigen räumlich-strukturellen Kontextes der Virusinfektion im Respirationstrakt des Frettchens bietet diese Arbeit die erste 3D-Rekonstruktion spezifischer SARS-CoV-2-Infektion, sowie weiterhin die erste 3D-Visualisierung respiratorischer Virusinfektion in der Nasenmuschel überhaupt. Mittels 3D-Objektsegmentierung von SARS-CoV-2-Infektionsherden in großvolumigen Gewebeproben wurde ein oligofokal verteiltes Infektionsmuster in den oberen Atemwegen des Frettchens identifiziert und hervorgehoben. Da in den unteren Atemwegen des Frettchens nur debrisassoziiertes Virusantigen nachweisbar war, wurde weiterhin die bevorzugte Replikation von SARS-CoV-2 in den oberen Atemwegen bestätigt und somit ein wesentlicher Beitrag zum Verständnis der räumlichen Verteilung von SARS-CoV-2 im Tiermodell Frettchen geleistet.

English. Technological advances in light microscopy have always gone hand in hand with unprecedented biological insight. For microbiology, light microscopy even played a founding role in the conception of the entire discipline. The ability to observe pathogens that would otherwise evade human observation makes it a critical necessity and an indispensable tool to infectious disease research. Thus, the aim of this thesis was to optimize, extend, and functionally apply advanced light microscopy techniques to elucidate spatio-temporal and spatio-morphological components of bacterial and viral infection in vitro and in vivo. Pathogens are in a constant arms race with the host’s immune system. By finding ways to circumvent host-mediated immune responses, they try to evade elimination and facilitate their own propagation. The first study (publication I) demonstrated that the obligate intracellular pathogen Coxiella burnetii is not just able to infect natural killer (NK) cells, but is actually capable of surviving the harsh degradative conditions in the cytotoxic lymphocyte’s granules. Using live-cell imaging of reporter-expressing Coxiella burnetii, the transient NK cell passage was closely monitored to provide detailed spatio-temporal information on this dynamic process in support of a range of static analyses. Bacterial release from NK cells was pinpointed to a time frame between 24 to 48 hours post-infection and the duration of release to about 15 minutes. The second approach (publications II-V) aimed at shedding light on the greater spatio-morphological context of virus infection. Thus far, most studies investigating the distribution or tropism of viruses in vivo have used conventional immunohistochemistry in thin sections. Omitting the native spatial context of the infection site in vivo inherently bears the risk of incomplete description. While the microscopic tools and sample preparation protocols needed for volumetric 3D immunofluorescence imaging have recently been made available, they had not gained a foothold in virus research yet. An integral part of this thesis was concerned with the assessment and optimization of available tissue optical clearing protocols to develop an immunofluorescence-compatible 3D imaging pipeline for the investigation of virus infection inside its intact spatio-morphological environment (publication II). This formed the basis for all subsequent volumetric analyses of virus infection in vivo presented here. Consequently, this thesis provided a valuable proof of concept and blueprints for future virus research on the mesoscopic scale of host-pathogen interactions in vivo (publications II-V), using rabies virus (RABV; publications II-IV) and the newly-emerged severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2; publication V) as infection models for the nervous system and the respiratory tract, respectively. Applying and further improving this volumetric 3D imaging workflow enabled unprecedented insights into the comprehensive in vivo cell tropism of RABV in the central (CNS) (publication III) and peripheral nervous system (PNS) (publication IV). Accordingly, differential infection of CNS-resident astrocytes by pathogenic and lab-attenuated RABV was demonstrated (publication III). While either virus variant showed equal capacity to infect neurons, as demonstrated by quantitative image analysis, only pathogenic field RABVs were able to establish non-abortive infection of astrocytes via the natural intramuscular inoculation route. A combined 3D LSFM-CLSM workflow further identified peripheral Schwann cells as a relevant target cell population of pathogenic RABV in the PNS (publication IV). This suggested that non-abortive infection of central and peripheral neuroglia by pathogenic RABV impairs their immunomodulatory function and thus represents a key step in RABV pathogenesis, which may contribute significantly to the establishment of lethal rabies disease. Finally, utilizing the full volumetric acquisition power of LSFM, a further refined version of the established 3D imaging pipeline facilitated a detailed mesoscopic investigation of the distribution of SARS-CoV-2 in the respiratory tract of the ferret animal model (publication V). Particularly for this newly-emerged pathogen of global concern, in-depth knowledge of host-pathogen interactions is critical. By preserving the complete spatio-morphological context of virus infection in the ferret respiratory tract, this thesis provided the first specific 3D reconstruction of SARS-CoV-2 infection and the first report of 3D visualization of respiratory virus infection in nasal turbinates altogether. 3D object segmentation of SARS-CoV-2 infection in large tissue volumes identified and emphasized a distinct oligofocal infection pattern in the upper respiratory tract (URT) of ferrets. Furthermore, it corroborated a preferential replication of SARS-CoV-2 in the ferret URT, as only debris-associated virus antigen was detected in the lower respiratory tract of ferrets, thus providing crucial information on the spatial distribution of SARS-CoV-2.