Secuenciación y análisis de dos genomas bacterianos: Thermus sp. 2.9 y Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4. Identificación y análisis funcional de proteínas/enzimas con aplicación agroindustrial

Tesis presentada para optar al título de Doctora en Biotecnología, de la Universidad de Buenos Aires, en 2015

La importancia de secuenciar genomas bacterianos radica, por un lado, en la información que resulta del análisis comparativo con genomas emparentados, contribuyendo al conocimiento de la diversidad, y por otro lado, en el aprovechamiento de genes con potencial aplicación biotecnológica que representen nuevas actividades o variantes mejoradas de las actuales. En este trabajo se secuenciaron dos genomas bacterianos mediante equipos de secuenciación masiva de ADN. Uno de ellos corresponde a una bacteria termófila, Thermus sp. 2.9, aislada de aguas termales de la provincia de Salta, con el objetivo de identificar enzimas termofílicas con aplicación en procesos industriales. El otro genoma secuenciado es el de un aislamiento de Bacillus thuringiensis llamado INTA Fr7-4 proveniente de suelos de la provincia de Misiones, estudiado para la búsqueda de proteínas insecticidas aplicables a la protección de cultivos. Para ensamblar el genoma de Thermus sp. 2.9 se probaron diversos programas y estrategias que permitan disminuir el número de contigs, obteniendo finalmente un genoma de 2,48 Mpb formado por un cromosoma bacteriano, distribuido en dos scaffolds, y otros tres scaffolds que representan el contenido plasmídico. La anotación del genoma permitió identificar 2719 genes codificantes de proteínas; y estudios comparativos revelaron la mayor cantidad de genes homólogos con T. aquaticus. Se encontraron 435 genes con potencial utilidad industrial y se expresaron cinco de ellos en E. coli. Se seleccionaron dos enzimas para su caracterización bioquímica. Una de ellas es una enzima con diversas actividades lipolíticas cuya temperatura óptima de actividad se estimó en 65 °C, y la otra una enzima oxidativa lacasa con actividad máxima a temperaturas entre 75-80 °C. B. thuringiensis es una bacteria Gram positiva que produce cristales parasporales con actividad insecticida (formados por proteínas Cry) durante la fase de esporulación. Algunos aislamientos producen también otras proteínas insecticidas solubles como las llamadas Vip. La secuenciación del genoma permitió ensamblar 5 scaffolds que forman el cromosoma bacteriano con un 99% de identidad al de B. bombysepticus Además, se obtuvo la secuencia completa de un nuevo megaplásmido de 260 kpb (pFR260). Éste contiene tres genes cry8, dos genes vip1, dos genes vip2 y un gen codificante de una proteína con características de una toxina Cry atípica. Existen genes de estas familias que han sido reportados en la literatura como tóxicos contra coleópteros; en este trabajo se describe por primera vez su organización en una isla de patogenicidad. Se seleccionaron los genes cry8Kb3 y cry8Pa3 y se sobreexpresaron individualmente con su propio promotor en una cepa acristalífera de B. thurigniensis, produciendo proteínas de 130 kDa y cristales ovoides. Los ensayos de actividad biológica de estas toxinas revelaron que la proteína Cry8Pa3 presenta niveles de toxicidad contra A. grandis (Coleoptera) semejantes a los de B. thuringiensis INTA Fr7-4.

Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMyZA)

Fil: Navas, Laura Emilce. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMyZA); Argentina