Estudios epidemiológicos de enfermedades infectocontagiosas en pequeños rumiantes domésticos y rumiantes silvestres desde una perspectiva One Health en el sur de España | Epidemiological studies of transmissible diseases in small domestic ruminants and wild ruminants from a One Health perspective in southern Spain

Los pequeños rumiantes representan el sector ganadero más vulnerable de la Unión Europea (UE), y actualmente se enfrenta a numerosos desafíos. Entre estos, destacan las enfermedades transmisibles por sus importantes consecuencias sanitarias y socioeconómicas, que pueden condicionar la viabilidad del sector. En Andalucía (sur de España), donde el sector ovino y caprino posee una gran relevancia, el conocimiento sobre diversos patógenos que circulan en estas especies es aún limitado. Además, en esta región los pequeños rumiantes suelen manejarse en condiciones extensivas, compartiendo hábitat, recursos, y también patógenos, con la fauna silvestre. El control de estos patógenos compartidos, algunos de los cuales tienen también relevancia en salud pública, requiere un enfoque desde la perspectiva de Una Sola Salud, involucrando a todos los actores implicados para reducir su transmisión entre humanos, animales domésticos y fauna silvestre. La presente Tesis Doctoral ha permitido profundizar en el conocimiento sobre la epidemiología de patógenos compartidos entre pequeños rumiantes domésticos y rumiantes silvestres en el sur de España, incluyendo el estudio de virus (Capítulo 1), bacterias (Capítulos 2 y 3) y parásitos (Capítulo 4). En los diferentes capítulos abordados en la presente Tesis Doctoral se ha evaluado la seroprevalencia, patrones espaciales y factores de riesgo asociados a diferentes patógenos que afectan, o pueden afectar a los rumiantes domésticos y silvestres, incluidos el Virus de la Peste de los Pequeños rumiantes (VPPR), Virus de Smallenberg (VSB), Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), micobacterias del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMT), Coxiella burnetii, Chlamydia abortus, Toxoplasma gondii y Neospora caninum. Además, se han evaluado las técnicas de confirmación postmorten de la infección por CMT en caprino. Para ello, se han realizado once estudios que abordan cada uno de los objetivos específicos de esta Tesis Doctoral. Los resultados del primer estudio (Capítulo 1.1) confirmaron la ausencia de circulación del VPPR en rumiantes domésticos y silvestres en Andalucía. La peste de los pequeños rumiantes (PPR) es una de las principales enfermedades transfronterizas del ganado y representa una gran amenaza para la producción animal. Aunque España es oficialmente un país libre de PPR, la proximidad del sur de España al norte de África, donde el virus circula activamente, convierte a esta región en una zona de alto riesgo para la entrada del VPPR. En el segundo estudio (Capítulo 1.2), se detectaron anticuerpos frente al VSB en un 29,8% (536/1796) de los pequeños rumiantes analizados y en el 76,7% (92/120) de las explotaciones incluidas en el estudio. La seroprevalencia individual fue del 31,1% (280/900) en ovejas y del 28,6% (256/896) en cabras, siendo menor que los valores observados tras los primeros brotes de la enfermedad en esta misma región. Además, la seropositividad se confirmó en cabras y ovejas de todas las provincias mediante seroneutralización vírica. Los factores de riesgo asociados con la exposición al VSB en pequeños rumiantes incluyeron el manejo extensivo, temperaturas medias superiores a 14ºC y altitudes inferiores a 400 metros. También se identificaron dos clústeres espaciales asociados a una mayor seroprevalencia a nivel de explotación localizados en las provincias de Huelva y Jaén. Este estudio proporciona información valiosa para priorizar las futuras acciones de vigilancia y control de VSB, y otros patógenos transmitidos por Culicoides. En el tercer estudio (Capítulo 2.1) la detección de anticuerpos frente a MAP en pequeños rumiantes del sur de España se realizó empleando un ELISA in-house. Se encontraron anticuerpos frente a MAP en el 8,1% (183/2266) de las ovejas y en el 20,0% (374/1868) de las cabras. Además, se detectó al menos un animal seropositivo en el 66,3% (55/83) de explotaciones de ovejas y en el 90,0% (63/70) de las de cabras. Los principales factores de riesgo potencialmente asociados con la exposición a MAP en estas especies fueron: la especie (cabra) y la ausencia de vallado perimetral. Asimismo, el análisis espacial identificó tres clústeres estadísticamente significativos asociados a áreas con una mayor seroprevalencia de la esperada frente a MAP. Los resultados obtenidos indican una distribución generalizada, aunque no homogénea, de MAP en las explotaciones de pequeños rumiantes del sur de España. En el cuarto estudio (Capítulo 2.2), se detectaron anticuerpos frente a CMT en 16 de las 2266 (0,7%) ovejas analizadas. El análisis de factores de riesgo identificó que el manejo extensivo es un potencial factor de riesgo asociado a la seropositividad frente a CMT en ovino. Aunque estudios previos han sugerido un posible papel de las ovejas como reservorio de CMT en determinados escenarios epidemiológicos, nuestros resultados indican que las ovejas no parecen tener un papel significativo en la epidemiología de la tuberculosis en Andalucía. En el quinto estudio (Capítulo 2.3) se detectó una elevada circulación de CMT en caprino, observándose una seroprevalencia individual del 21,9% (473/2155) y al menos un animal seropositivo en el 90% (72/80) de las explotaciones analizadas. El modelo de ecuaciones de estimación generalizada mostró que el sistema de manejo (mayor seroprevalencia en granjas intensivas y semi-intensivas) y la presencia de lazareto dentro de las instalaciones de la explotación, fueron factores de riesgo potencialmente asociados con la exposición al CMT en cabras en el sur de España. La distribución espacial de CMT en caprino de Andalucía tampoco fue homogénea, identificándose un clúster espacial estadísticamente significativo en el este de esta región. Adicionalmente, en el área de estudio, se identificaron un total de 16 espoligotipos diferentes de CMT en cabras, incluyendo cinco de M. caprae y 11 de M. bovis, siendo SB0157 el más frecuentemente aislado. Estos resultados sugieren que las cabras podrían desempeñar un papel en el mantenimiento y la transmisión del CMT en Andalucía, lo que subraya la importancia de implementar o evaluar las medidas de control en esta especie. El objetivo del sexto estudio (Capítulo 2.4) fue comparar el uso de diferentes técnicas de diagnóstico para la confirmación post-mortem de la infección por CMT en cabras positivas a las pruebas oficiales de intradermotuberculinización. Las técnicas evaluadas fueron la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real directa en tejidos (RT-PCR), el cultivo microbiológico, la observación de lesiones macroscópicas e histopatológicas compatibles con TB (LTB) y la tinción de Ziehl-Neelsen. La RT-PCR directa en tejidos mostró la mayor tasa de animales positivos para la confirmación post-mortem de la infección por CMT (86,3%) en comparación con la oficial, seguida de la observación histopatológica (49,3%) y macroscópica (47,8%) de LTB, el cultivo de CMT (42,4%) y, por último, la tinción de Ziehl-Neelsen (8,5%). Nuestros resultados indican que la RT-PCR directa en tejido es una técnica sensible y eficaz para la confirmación post-mortem de la infección por CMT en los programas de control y erradicación de la tuberculosis caprina, incluso en animales sin LTB. En el séptimo estudio (Capítulo 3.1), se observó una seroprevalencia individual frente a C. burnetii del 49,1% (383/780) en pequeños rumiantes. Por especie, se encontraron anticuerpos frente a esta bacteria en el 40,0% (156/390) de las ovejas y en el 58,2% (227/390) de las cabras. Se encontró al menos un animal seropositivo en todas las explotaciones de ovino (100%; 26/26) y en el 92,3% (24/26) de las de caprino. La especie (caprino) y la existencia de trastornos reproductivos en hembras primíparas fueron factores de riesgo potencialmente asociados a la exposición a C. burnetii en explotaciones de pequeños rumiantes. La elevada exposición de estas especies a C. burnetii puede representar un riesgo significativo tanto para la sanidad animal como para la salud pública. En cambio, las seroprevalencias detectadas en muflones (Ovis aries musimon; 1,8%; 2/110), ciervos (Cervus elaphus; 1,5%; 6/390) y cabras monteses (Capra pirenaica; 1,0%; 1/105) indican una exposición limitada de estas especies a C. burnetii en el sur de España. Por tanto, nuestros resultados sugieren la existencia ciclos epidemiológicos independientes entre rumiantes domésticos y silvestres en el área de estudio. En el octavo estudio (Capítulo 3.2) la seroprevalencia individual frente a C. abortus observada fue del 22,8% (89/390) en ovino y del 34,1% (133/390) en caprino. A nivel de explotación, el 76,9% (40/52) de los rebaños mostró seropositividad frente a C. abortus. El análisis espacial identificó un clúster estadísticamente significativo en la zona oriental de Andalucía. El sistema de manejo (intensivo y semi-intensivo) y el censo de la granja (≥ 492 individuos) fueron identificados como factores de riesgo potencialmente asociados con la exposición a C. abortus en pequeños rumiantes. En cambio, la seroprevalencia global frente a C. abortus en rumiantes silvestres (2,6%; 16/605) fue significativamente inferior a la observada en rumiantes domésticos. Los valores de seroprevalencia por especie fueron del 1,8% (7/390) en ciervos, del 3,8% (4/105) en cabras monteses y del 4,6% (5/110) en muflones. La elevada exposición a C. abortus detectada en pequeños rumiantes domésticos podría provocar pérdidas económicas significativas para este sector ganadero y podría suponer un riesgo para tanto para la sanidad animal como para la salud pública. Sin embargo, la baja seropositividad observada en las poblaciones de rumiantes silvestres simpátricos sugiere un papel limitado de estas especies en el ciclo epidemiológico de C. abortus en el área de estudio. En el noveno estudio (Capítulo 4.1) se observó una seroprevalencia individual frene a T. gondii del 46,5% (464/998) en ovino y del 38,3% (362/945) en caprino, empleando el test de aglutinación modificada (MAT). La detección de animales seropositivos en el 98,4% (63/64) y el 93,7% (59/63) de las granjas de ovejas y cabras, respectivamente, indica una distribución generalizada de T. gondii en las poblaciones de pequeños rumiantes del sur de España. Sin embargo, la distribución espacial de este protozoo no fue homogénea, ya que el análisis espacial detectó una seropositividad significativamente mayor en las granjas del centro-norte de Andalucía. La presencia de gatos y la existencia de trastornos reproductivos se identificaron como factores de riesgo potenciales asociados con la exposición a T. gondii en pequeños rumiantes en el área de estudio. La elevada circulación de T. gondii detectada en nuestro estudio pone de manifiesto el potencial problema sanitario de este protozoo en las explotaciones de ovinos y caprinos en Andalucía, dado que trata de una de las principales causas de aborto en estas especies. Además, esta alta circulación de T. gondii podría tener también un impacto para la salud pública. En el décimo estudio (Capítulo 4.2) se continuó con serovigilancia de T. gondii, en este caso en ungulados silvestres que cohabitan en el Parque Natural de las Sierras de Cazorla, Segura y Las Villas (noreste de Andalucía). Se determinó la presencia de anticuerpos frente a T. gondii en 328 ungulados silvestres empleando la misma metodología y se detectó exposición a T. gondii en las cinco especies de ungulados silvestres de caza mayor presentes en el Parque Natural durante seis temporadas de caza. Concretamente, se detectaron anticuerpos frente a T. gondii en 5 de los 24 jabalíes (Sus scrofa; 20,8%), 12 de los 63 gamos (Dama dama; 19,0%), 14 de las 101 cabras monteses (13,9%), 6 de los 76 ciervos (7,9%) y 2 de los 64 muflones (3,1%) analizados. Se observaron seroprevalencias significativamente más elevadas en gamos y jabalíes en comparación con los muflones. Además, los animales que habitaban cerca de zonas urbanas (<2 km) mostraron una seroprevalencia frente a T. gondii significativamente superior que aquellos que habitaban a más de 5 km. Nuestros resultados sugieren que para evitar la infección por T. gondii, sería recomendable cocinar completamente la carne de caza antes de su consumo. En el onceavo y último estudio que integra esta Tesis Doctoral (Capítulo 4.3) se analizaron muestras de suero de 390 ovejas y 387 muflones para detectar anticuerpos frente a N. caninum utilizando la fluorometría en tiempo retardado con NcGRA7 como antígeno recombinante. La seroprevalencia individual fue del 26,2% (102/390) en ovejas y del 5,7% (22/387) en muflones. El modelo de regresión logística múltiple identificó que los principales factores de riesgo potencialmente asociados con la exposición a N. caninum en ovejas fueron la presencia de perros en la granja (≥3) y la raza de los animales (raza pura). La elevada seroprevalencia detectada frente a este protozoo en ovino sugiere que debería ser incluido en el diagnostico diferencial en caso de aborto en esta especie. Asimismo, nuestros resultados destacan el papel del muflón como posible hospedador intermedio en el ciclo silvestre de este parásito, como se ha observado en otros rumiantes silvestres en España. No obstante, estudios futuros deberían evaluar las repercusiones clínicas de este protozoo en ovino y muflones y sus posibles implicaciones en la sanidad animal y para la biodiversidad de ésta y otras especies silvestres. En resumen, los resultados obtenidos en los diferentes capítulos de la presente Tesis Doctoral subrayan la importancia de la vigilancia sanitaria en las poblaciones de rumiantes domésticos y silvestres en Andalucía. Los hallazgos encontrados han permitido una mejor comprensión de la distribución de importantes patógenos compartidos entre el ganado doméstico y la fauna silvestre. Además, esta Tesis proporciona información útil para la selección de estrategias dirigidas a establecer y optimizar las medidas de lucha y prevención de enfermedades de importancia para sanidad animal, la salud pública y la conservación de la biodiversidad en Andalucía.

Small ruminants represent the most vulnerable livestock sector in the European Union (EU) and currently face numerous challenges. Among these, transmissible diseases are particularly relevant due to their significant health and socioeconomic consequences, which can affect the sector’s viability. In Andalusia (southern Spain), a key region driving Spain's sheep and goat sector, knowledge about several pathogens affecting these species remains limited. Additionally, in this region, small ruminants are often extensively raised, sharing habitat, resources, and pathogens with wildlife. Effective control of these shared pathogens, some of which are also of public health concern, requires a One Health approach that involves all stakeholders to reduce transmission between humans, domestic animals, and wildlife. This Doctoral Thesis enhances the understanding of the epidemiology of pathogens shared between domestic small ruminants and wild ruminants in southern Spain, focusing on viruses (Chapter 1), bacteria (Chapters 2 and 3), and parasites (Chapter 4). In the different chapters of this Doctoral Thesis, we evaluated seroprevalence, spatial distribution, and risk factors associated with different pathogens affecting or potentially affecting domestic and wild ruminants. This included Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV), Schmallenberg Virus (SBV), Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP), mycobacteria of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), Coxiella burnetii, Chlamydia abortus, Toxoplasma gondii, and Neospora caninum. Additionally, we assessed diagnostic techniques for post-mortem confirmation of MTC infection in goats. To address each of the specific objectives of this Doctoral Thesis eleven studies were conducted. The results of the first study (Chapter 1.1) confirmed the absence of PPRV circulation in domestic and wild ruminants in Andalusia. Peste des Petits Ruminants (PPR) is one of the main transboundary livestock diseases and represents an animal health concern. While Spain is considered a PPR-free country, the proximity of southern Spain to North Africa, where the virus circulates actively, makes this region a high-risk area for the potential entry of PPRV. In the second study (Chapter 1.2), antibodies against SBV were detected in 29.8% (536/1796) of the small ruminants analyzed and in 76.7% (92/120) of the farms included in the study. The individual seroprevalence was 31.1% (280/900) in sheep and 28.6% (256/896) in goats, values lower than those observed after the first outbreaks of the disease in the same region. Additionally, seropositivity to SBV was confirmed in goats and sheep from all provinces using virus neutralization test. Risk factors associated with SBV exposure in small ruminants included extensive management, average temperatures above 14°C, and altitudes below 400 metres above sea level. Two spatial clusters associated with higher seroprevalence at the farm level were also identified in the provinces of Huelva and Jaen. This study provides valuable information for prioritizing future surveillance and control actions for SBV and other Culicoides-borne pathogens. In the third study (Chapter 2.1), the detection of antibodies against MAP in small ruminants in southern Spain was performed using an in-house ELISA. Antibodies against MAP were found in 8.1% (183/2266) of sheep and 20.0% (374/1868) of goats. Additionally, at least one seropositive animal was detected in 66.3% (55/83) of sheep farms and 90.0% (63/70) of goat farms. The main potential risk factors associated with MAP exposure in these species were species (goat) and absence of perimeter livestock fencing. Spatial analysis also identified three statistically significant clusters associated with areas with higher seroprevalence of MAP. The results indicate a widespread, though not homogeneous, distribution of MAP in small ruminant farms in southern Spain. In the fourth study (Chapter 2.2), antibodies against MTC were detected in 16 (0.7%) of the 2266 sheep analyzed. Risk factor analysis identified extensive management as a potential risk factor associated with MTC seropositivity in sheep. Although previous studies have suggested that sheep may act as a reservoir for MTC in certain epidemiological scenarios, our results indicate that this ruminant species do not seem to play a significant role in the epidemiology of tuberculosis in Andalusia. In the fifth study (Chapter 2.3), a high circulation of MTC in goats was detected, with an individual seroprevalence of 21.9% (473/2155) and at least one seropositive animal in 90% (72/80) of the farms analyzed. The generalized estimating equations model showed that the management system (higher seroprevalence in intensive and semiintensive farms) and the presence of hospital pens inside the regular stables were potential risk factors associated with MTC exposure in goats in southern Spain. The spatial distribution of MTC in goats in Andalusia was also heterogeneous, with a statistically significant spatial cluster identified in the eastern part of this region. Additionally, a total of 16 different MTC spoligotypes were identified in goats in the study area, including five of M. caprae and 11 of M. bovis, with SB0157 being the most frequently isolated. These results suggest that goats could play a relevant role in the maintenance and transmission of MTC in Andalusia, highlighting the importance of implementing or evaluating control measures in this species. The objective of the sixth study (Chapter 2.4) was to compare the use of different diagnostic techniques for post-mortem confirmation of MTC infection in goats positive to official tuberculin skin tests. The techniques evaluated were direct tissue Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), microbiological culture, observation of macroscopic and histopathological lesions compatible with TB (TBL), and Ziehl-Neelsen staining. Direct RT-PCR on tissues showed the highest rate of positive animals for post-mortem confirmation of MTC infection (86.3%) compared to the official method, followed by histopathological (49.3%) and macroscopic (47.8%) observation of TBL, MTC culture (42.4%), and finally, Ziehl-Neelsen staining (8.5%). Our results indicate that direct RT-PCR in tissue is a sensitive and effective technique for post-mortem confirmation of MTC infection in goat tuberculosis control and eradication programs, even in animals without visible TBL. In the seventh study (Chapter 3.1), an individual seroprevalence to C. burnetii of 49.1% (383/780) was observed in small ruminants. By species, antibodies against this bacterium were found in 40.0% (156/390) of sheep and 58.2% (227/390) of goats. At least one seropositive animal was detected in all sheep farms (100%; 26/26) and in 92.3% (24/26) of goat farms. Potential risk factors for C. burnetii exposure in small ruminant farms included the species (goat) and the existence of reproductive disorders in primiparous females. The high exposure of these species to C. burnetii may represent a significant risk for both animal health and public health. In contrast, the seroprevalences detected in mouflon (Ovis aries musimon; 1.8%; 2/110), red deer (Cervus elaphus; 1.5%; 6/390), and Iberian ibex (Capra pyrenaica; 1.0%; 1/105) indicate limited exposure of these species to C. burnetii in southern Spain. Thus, our results suggest the existence of independent epidemiological cycles between domestic and wild ruminants in the study area. In the eighth study (Chapter 3.2), individual seroprevalence against C. abortus was 22.8% (89/390) in sheep and 34.1% (133/390) in goats. At the farm level, 76.9% (40/52) of the herds showed seropositivity against C. abortus. The spatial analysis revealed a statistically significant cluster in eastern Andalusia. The management system (intensive and semi-intensive) and the farm size (≥ 492 individuals) were identified as potential risk factors associated with exposure to C. abortus in small ruminants. In contrast, the overall seroprevalence against C. abortus in wild ruminants (2.6%; 16/605) was significantly lower than that observed in domestic ruminants. The seroprevalence values by species were 1.8% (7/390) in red deer, 3.8% (4/105) in Iberian ibex, and 4.6% (5/110) in mouflon. The high exposure to C. abortus detected in domestic small ruminants could lead to significant economic losses for this livestock sector and raises concerns for animal and public health. However, the low seropositivity observed in sympatric wild ruminant populations suggests a limited role of these species in the epidemiological cycle of C. abortus in the study area. In the ninth study (Chapter 4.1), individual seroprevalence against T. gondii was found to be 46.5% (464/998) in sheep and 38.3% (362/945) in goats, using the modified agglutination test (MAT). The detection of seropositive animals in 98.4% (63/64) of sheep farms and 93.7% (59/63) of goat farms indicates a widespread distribution of T. gondii in small ruminant populations in southern Spain. However, the spatial distribution of this protozoan was not homogeneous; spatial analysis revealed significantly higher seropositivity in farms located in the central-northern part of Andalusia. The presence of cats and reproductive disorders were identified as potential risk factors associated with exposure to T. gondii in small ruminants in the study area. The high circulation of T. gondii observed in our study underscores the potential health problem of this protozoan in sheep and goat farms in Andalusia, as it is one of the main causes of abortion in these species. Additionally, this high T. gondii circulation raises public health concerns. In the tenth study (Chapter 4.2), serosurveillance of T. gondii was carried out in wild ungulates cohabiting in Sierras de Cazorla, Segura and Las Villas Natural Park (northeastern Andalusia). The presence of antibodies against T. gondii was determined in 328 wild ungulates using the same diagnostic method, and exposure to T. gondii was detected in the five species of wild ungulates present in the Natural Park over six hunting seasons. Specifically, antibodies against T. gondii were detected in 5 of 24 wild boars (Sus scrofa; 20.8%), 12 of 63 fallow deer (Dama dama; 19.0%), 14 of 101 Iberian ibex (13.9%), 6 of 76 red deer (7.9%), and 2 of the 64 mouflons (3.1%) analyzed. Significantly higher seroprevalence was observed in fallow deer and wild boars compared to mouflons. Animals living close to urban areas (<2 km) had 4.6-times higher risk compared to those living at >5 km of these areas. Our results suggest that, to prevent T. gondii infection, game meat should be thoroughly cooked before human consumption. In the eleventh and last study of this Doctoral Thesis (Chapter 4.3), serum samples from 390 sheep and 387 mouflons were analyzed to detect antibodies against N. caninum using a time-resolved fluorescence immunoassay based on commercial dense granule 7 (GRA7) recombinant antigen. The individual seroprevalence was 26.2% (102/390) in sheep and 5.7% (22/387) in mouflon. The multiple logistic regression model identified that the main potential risk factors associated with exposure to N. caninum in sheep were the presence of dogs on the farm (≥3) and the breed of the animals (purebred). The high seroprevalence detected against this protozoan in sheep suggests that it should be included in the differential diagnosis in case of abortion in this species. Additionally, our results highlight the role of the mouflon as a potential intermediate host in the wild cycle of this parasite, as observed in other wild ruminants in Spain. However, future studies should evaluate the clinical implications of this protozoan in sheep and mouflons and its potential implications for animal health and conservation of this and other wild species. In summary, the results obtained in the various chapters of this Doctoral Thesis underscore the importance of health surveillance in domestic and wild ruminant populations in Andalusia. The findings have enhanced our understanding of the distribution of significant pathogens shared between domestic livestock and wildlife. Additionally, this Doctoral Thesis provides valuable insights for developing and optimizing strategies aimed at implementing control and prevention measures for diseases that impact to animal health, public health, and biodiversity conservation in Andalusia.