Organization in nanodomains and function in the regulation of water transport of Arabidopsis HIR2 protein | Organisation en nanodomaines et fonction dans la régulation du transport de l'eau de la protéine HIR2 d'Arabidopsis

English. HIRs are plant-specific proteins belonging to the superfamily of SPFH domain-containing proteins that were proposed to play scaffolding functions in membranes. HIR2 isoform organizes in plasma membrane nanodomains that correspond to nanometric scale structures enriched in specific lipids and proteins acting as signaling/regulation platforms. So far, how plasma membrane nanodomains are formed and maintained in plant cells remains largely unknown. I investigated the mechanisms governing the trafficking and the organization into nanodomains of Arabidopsis HIR2 protein. We revealed that the mono S-acylation of HIR2 was required for HIR2 targeting to the plasma membrane of Arabidopsis cells, but not for HIR2 nanoclustering. Investigating the mechanisms implicated in the arrangement of HIR2 into nanodomains, we provided evidences that the lipid composition in sterols and very long chain fatty acids of the plasma membrane influences HIR2 organization. HIR2 was previously shown to oligomerize and we demonstrated here that the C-terminal part of HIR2 is required for self-assembly. Interestingly, we highlighted that the oligomerization of HIR2 was essential for its organization in nanodomains and for its functionality. So far, the molecular functions of HIR proteins remain largely unknown. HIRs have been identified in the interactome of Arabidopsis PIP aquaporins, these later facilitating water and H₂O₂ diffusion across membranes. We investigated a putative role of HIR2 in the regulation of PIP proteins. We showed that HIR2 forms a complex with several PIP proteins. Additionally, we observed that HIR mutations induced an important decrease in the root hydraulic conductivity (Lpr) in Arabidopsis, the Lpr being largely controlled by PIP proteins. This reduction in the Lpr is not due to an altered root architecture in hir mutants. Instead, our studies showed that the PIP-mediated water transport in roots was largely impaired in hir mutants. Investigating the reasons for this PIP deregulation, we observed by confocal microscopy that the overall subcellular localization of PIP2;1 remained unchanged in hir mutants. Additionally, PIP protein accumulation was unaffected in hir mutants. Interestingly super resolution microscopy revealed that HIR mutations had an impact on PIP2;1 organization within nanodomains. Further, functionality tests performed in yeast revealed that HIR2 enhanced the PIP2;1-mediated transport of H2O2, suggesting a positive regulatory role of HIR2 on PIPs. Phospho-proteomic analysis suggested that the phosphorylation level of some PIPs was lower in hir2 single mutant compared to wild-type plants. Since the phosphorylation of PIPs is crucial for their activity, this might explain, at least in part, the reduction in Lpr. However, intriguingly, similar effects on PIP phosphorylation were not observed in a hir1hir2hir4 triple mutant. Interestingly, we demonstrated that HIR2 could stimulate the apoplastic ROS accumulation in response to flg22. Moreover, Arabidopsis hir mutants showed delayed stomatal closure following flg22 stimulation. Using the Hyper7 H₂O₂ biosensor, we highlighted that HIRs are implicated in H₂O₂ diffusion and cytoplasmic H₂O₂ accumulation in stomatal guard cells. HIRs may regulate PIP activity to modulate H₂O₂ transport, which is crucial for plant immunity. In conclusion, we propose that HIRs act as scaffolding proteins to recruit and/or stabilize PIP proteins in specific plasma membrane nanodomains to modulate PIP activity, which has an impact on plant hydraulics and immunity.

French. Les HIRs sont des protéines spécifiques des plantes qui appartiennent à la superfamille des protéines à domaine SPFH, jouant un rôle d’échafaudage dans les membranes. Dans la membrane plasmique, l’isoforme HIR2 s’organise en nanodomaines, structures de taille nanométrique enrichies en lipides et en protéines spécifiques agissant comme des plateformes de signalisation/régulation. Jusqu’à présent, la façon dont les nanodomaines de la membrane plasmique sont formés et maintenus dans les cellules végétales reste largement inconnue. J’ai étudié les mécanismes régissant le trafic et l’organisation en nanodomaines de la protéine HIR2 d’Arabidopsis. Nous avons montré que la mono S-acylation de HIR2 était nécessaire pour l’adressage de HIR2 vers la membrane plasmique, mais n’était pas impliquée dans le nanoclustering de HIR2. En étudiant les mécanismes impliqués dans l’arrangement de HIR2 en nanodomaines, nous avons démontré que la composition lipidique en stérols et en acides gras à très longue chaîne de la membrane plasmique influence l’organisation de HIR2. Il a été montré précédemment que HIR2 formait des oligomères, et nous avons démontré ici que la partie C-terminale de HIR2 était nécessaire pour son auto-assemblage. Nous avons ensuite mis en évidence que l’oligomérisation de HIR2 était essentielle pour son organisation en nanodomaines et pour sa fonction.Jusqu’à présent, les fonctions moléculaires des protéines HIR restent méconnues. Des HIRs ont été identifiées dans l’interactome des aquaporines PIP d’Arabidopsis, qui facilitent la diffusion de l’eau et de H₂O₂ à travers les membranes. Nous avons étudié le rôle putatif de HIR2 dans la régulation des protéines PIP. Nous avons montré que HIR2 forme un complexe avec plusieurs protéines PIP. De plus, nous avons observé que les mutations des gènes HIR induisaient une diminution importante de la conductivité hydraulique des racines (Lpr), la Lpr étant largement contrôlée par les PIPs. Cette réduction de la Lpr n’est pas due à une architecture racinaire altérée chez les mutants hir, mais résulte d’une perturbation du transport d’eau médié par les PIPs. Recherchant la raison de cette dérégulation des PIP, nous avons observé que lalocalisation subcellulaire globale de PIP2;1 ainsi que l’accumulation des protéines PIP restaient inchangées chez les mutants hir. Néanmoins, des analyses de microscopie à super-résolution ont révélé que les mutations HIR avaient un impact sur l’organisation de PIP2;1 au sein des nanodomaines. En outre, des tests de fonctionnalité réalisés dans la levure ont révélé que HIR2 améliorait le transport de H₂O₂ médié par PIP2;1, suggérant un rôle régulateur positif de HIR2 sur les PIPs. Une analyse phospho-protéomique a suggéré que le niveau de phosphorylation de certaines PIPs était plus faible chez le simple mutant hir2 que chez des plantes sauvages. Étant donné que la phosphorylation des PIPs est cruciale pour leur activité, ceci pourrait expliquer, au moins en partie, la réduction de la Lpr. Cependant, cette différence de phosphorylation des PIPs n’a pas été observée dans un triple mutant hir1hir2hir4.De façon intéressante, nous avons démontré que HIR2 pouvait stimuler l’accumulation apoplastique de ROS en réponse à flg22. De plus, les mutants hir d’Arabidopsis ont montré une fermeture stomatique retardée en réponse à flg22. En utilisant le biosenseur de H₂O₂ Hyper7, nous avons mis en évidence que les HIRs étaient impliquées dans la diffusion de H₂O₂ et dans l’accumulation de H₂O₂ cytoplasmique dans les cellules de garde. Les HIRs pourraient réguler l’activité des PIPs pour moduler le transport de H₂O₂, ce qui est crucial pour l’immunité des plantes.En conclusion, nous proposons que les HIRs agissent comme des protéines d’échafaudage pour recruter et/ou stabiliser les protéines PIP dans des nanodomaines spécifiques de la membrane plasmique afin de moduler leur activité, ce qui a un impact sur l’hydraulique et l’immunité des plantes.