PL: Rola estrogenów w rozwoju lub zapobieganiu chłoniakowi u psów | EN: A role of estrogens in the development or prevention of canine lymphoma

abstractPL: Chłoniak wieloogniskowy jest jednym z najczęściej diagnozowanych nowotworów u psów. Jest chorobą proliferacyjną wywodzącą się z komórek układu limfoidalnego. Z tego względu może obejmować wszystkie organy, w których obecna jest tkanka limfatyczna - m.in. węzły chłonne, śledzionę, wątrobę i szpik kostny. Pełna diagnostyka psiego pacjenta podejrzanego o występowanie chłoniaka obejmuje: pobranie aspiratu lub bioptatu węzła chłonnego metodą odpowiednio: biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej lub biopsji wycięciowej. W celu określenia stopnia zaawansowania choroby – tzn. organów objętych procesem nowotworowym (tzw. „staging”) wykonuje się badania obrazowe takie jak: badanie ultrasonograficzne jamy brzusznej, badanie tomografii komputerowej, zdjęcie rentgenowskie klatki piersiowej oraz badania dodatkowe: badanie moczu, badanie krwi, rozmaz krwi, biopsję szpiku czy narządów wewnętrznych. Częścią tej oceny jest również ustalenie fenotypu komórek chłoniaka, tzn. określenie, z której linii limfocytarnej (limfocyty „B” lub „T”) wywodzą się zmienione chorobowo komórki danego pacjenta. „Złoty standard” leczenia chłoniaka wieloogniskowego u psów obejmuje wielolekowy protokół chemioterapii. Średni czas przeżycia (MST) u pacjentów, których poddano terapii wynosi 215-221 dni. Badania epidemiologiczne wykazały, iż chłoniak występuje częściej u samców niż u samic, a także u samic kastrowanych w porównaniu z sukami nie poddanymi zabiegowi gonadektomii. Podobną tendencję obserwuje się u ludzi, gdyż u kobiet ryzyko zachorowania na nowotwory takie jak: chłoniak nieziarniczy, przewlekła białaczka limfatyczna, ostra białaczka limfocytarna z komórek B czy chłoniak Burkitta jest mniejsze. W wielu przypadkach płeć żeńska jest również uznawana za korzystny czynnik prognostyczny. Mimo że nie udało się dotychczas ustalić dokładnej przyczyny tego zjawiska, jako potencjalne wyjaśnienie wskazano wpływ hormonów płciowych, w tym estrogenów i ich receptorów na ekspresję genów, a także bezpośredni wpływ na komórki nowotworowe. Działanie estrogenów odbywa się poprzez wiązanie się z receptorami estrogenowymi (ER) i aktywację procesów transkrypcyjnych i sygnalizacyjnych, które skutkują kontrolą ekspresji genów. Istnieją dwa główne typy receptorów estrogenowych: ER alfa (ERα) i ER beta (ERβ). Receptory te są zlokalizowane w różnych tkankach a ich ekspresja różni się w zależności od typu tkanki, gatunku czy typu nowotworu. W ludzkich nowotworach układu krwiotwórczego dominującym receptorem jest ERβ, podczas gdy w tkankach psów na przestrzeni dziesięcioleci nie wykryto żadnej lub jedynie marginalną ekspresję ER. Analiza literatury pozwoliła na zdefiniowanie celu i zakresu niniejszej dysertacji. Pierwszym celem pracy było zbadanie poziomu ekspresji receptora estrogenowego na nowotworowo zmienionych limfocytach psa, czego dokonano za pomocą techniki Western Blot z zastosowaniem przeciwciał o potwierdzonej reaktywności krzyżowej z limfocytami psa. Analizę przeprowadzono zarówno na dostępnych komercyjnie liniach komórkowych różnych typów chłoniaka i białaczki psa, jak i materiale pobranym metodą biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej od psów z potwierdzonym cytologicznie chłoniakiem multicentrycznym. Badaniom poddano także limfocyty izolowane z krwi psów zdrowych. Udokumentowaną ekspresję receptora ERα, w dalszej kolejności potwierdzono badaniem metodą cytometrii przepływowej. Kolejnym etapem pracy było określenie wpływu stymulacji receptora estrogenowego na komórki chłoniaka lub białaczki u psów. W badaniach wstępnych do oznaczania cytotoksyczności otrzymanych związków in vitro wykorzystano test MTT. Komórki linii chłoniaka (CLBL-1) oraz 2 linii białaczki (CLBL70 i GL-1) psa inkubowano z 3 agonistami receptorów ER: DPN, PPT i estradiolem. W dalszej kolejności ocenie poddano żywotność komórek z zastosowaniem barwienia jodkiem propidyny i aneksyną V w badaniu metodą cytometrii przepływowej. W kolejnej sekcji opisano przeprowadzone analogiczne analizy wraz z wynikami, dla 16 pochodnych estrogenów, otrzymanych z estradiolu, estronu i etynyloestradiolu w wyniku biotransformacji w kulturach grzybów strzępkowych z gatunku Isaria fumosorosea w Katedrze Chemii Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Uniwersytetu Przyrodniczego. Kolejne dwie sekcje przedstawiają wyniki dalszych badań trzech wyselekcjonowanych pochodnych o największym potencjale zarówno cytotoksycznym jak i użyteczności klinicznej: 17β-estradiolu, Estriolu i 17α-estradiolu. Dla wymienionych związków wykonano barwienie jodkiem propidyny i aneksyną V oraz analizę cytometryczną. W ostatniej, klinicznej części pracy doktorskiej opisano i przedstawiono wyniki projektu ONCOFLOW, polegającego na analizie cytometrycznej materiału pobranego metodą biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej od 54 psów w różnych placówkach weterynaryjnych w Polsce i we Włoszech. Aspiraty węzłów chłonnych analizowano w ciągu 24 godzin od pobrania za pomocą standardowego panelu diagnostycznego w celu określenia fenotypu choroby nowotworowej. Dodatkowo, w każdej próbce oceniano rekombinowane przeciwciało przeciwko receptorowi estrogenowemu alfa [E115] (PE) na komórkach nowotworowych. Na podstawie wyników FC przypadki pogrupowano na chłoniaki z komórek B (n=43), chłoniaki z komórek T (n=9) i ostre białaczki limfoblastyczne (n=2). Kryteriami włączenia do grupy badawczej była diagnoza cytologiczna/histologiczna przeprowadzona przez patologa, brak wcześniejszego leczenia glikokortykosteroidami lub cytostatykami oraz dostarczenie konkretnych danych pacjenta. 32 przypadki poddano dalszej ocenie pod kątem płci oraz zabiegu gonadektomii. Wyniki przeprowadzonych badań doprowadziły do następujących konkluzji: receptorem estrogenowym, który ulega ekspresji na komórkach nowotworów układu krwiotwórczego psów jest ERα, w przeciwieństwie do ludzi, u których dominującym jest ERβ. Inkubacja komórek chłoniaka/białaczki psa z nieselektywnymi i selektywnymi agonistami receptorów estrogenowych powoduje zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych, a także indukuje apoptozę. 17-β-estradiol, estriol, 17-β-etynyloestradiol i 17-α-estradiol to pochodne estrogenów o najwyższym potencjale cytotoksycznym wobec komórek chłoniaka i białaczki psów. W wyniku analizy danych projektu klinicznego wysunięto następujące wnioski: różne podtypy chłoniaka różnią się pod względem ekspresji ERα, przy czym dominuje ona w rozlanym chłoniaku z dużych komórek B, a poziom ekspresji ERα prawdopodobnie zmieniony jest u pacjentów poddanych gonadektomii.

abstractEN: Multicentric lymphoma is one of the most frequently diagnosed cancers in dogs. It is a proliferative disease originating from cells of the lymphoid system. It may occur in all organs where lymphatic tissue is present - including: lymph nodes, spleen, liver, and bone marrow. Full diagnostics of a canine patient suspected of having lymphoma includes: collecting an aspirate or biopsy of a lymph node using the fine-needle aspiration or excisional biopsy, respectively. A complete staging includes: abdominal ultrasound, computed tomography, chest X-ray, and additional tests: urine test, blood test, blood smear, bone marrow or internal organ biopsy. Part of this assessment also includes examining a patient sample to determine the phenotype of the disease, i.e. determining which lymphocytic lineage ("B" or "T" cells) the diseased cells of a given patient originate from. The “gold standard” treatment for multicentral lymphoma in dogs involves a multidrug chemotherapy protocol. The median survival time (MST) in patients who underwent chemotherapy is 215-221 days. Epidemiological studies have shown that lymphoma occurs more often in males than in females, as well as in neutered females compared to females that have not undergone gonadectomy. A similar tendency is observed in humans, as women have a lower risk of developing cancers such as non-Hodgkin's lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, B-cell acute lymphocytic leukemia or Burkitt's lymphoma. In many cases, female gender is also considered a favorable prognostic factor. Although the exact cause of this phenomenon has not yet been determined, the influence of sex hormones, including estrogens and their receptors on gene expression, as well as a direct effect on cancer cells, have been suggested as a potential explanation. Estrogen acts by binding to estrogen receptors (ERs) and activating transcription and signaling processes that control gene expression. There are two main types of estrogen receptors: ER alpha (ERα) and ER beta (ERβ). These receptors are located in various tissues and their expression varies depending on the type of tissue, species, or type of cancer. In human hematologic malignancies, ERβ is the predominant receptor, whereas no or only marginal ER expression has been detected in dog tissues over the decades. The analysis of the literature allowed us to define the purpose and scope of this dissertation, which were to look for the presence of estrogen receptors on canine neoplastic lymphocytes and to investigate estrogen derivatives that potentially can stimulate these receptors. The study’s first aim was to prove the expression of the estrogen receptor on canine lymphocytes, which was done by the Western Blot technique using antibodies with confirmed cross-reactivity with canine cells. The analysis was performed both on commercially available cell lines of various types of canine lymphoma and leukemia, as well as on material collected by fine-needle aspiration biopsy from dogs with cytologically confirmed multicentric lymphoma. Lymphocytes isolated from the blood of healthy dogs were also tested. The documented expression of the ERα receptor was further confirmed by flow cytometry. The next stage of the dissertation was to determine the effect of estrogen receptor stimulation on canine lymphoma or leukemia cells. In preliminary studies, the MTT test was performed to determine the cytotoxicity of the estrogen receptor agonists towards cells in in vitro cultures. Canine lymphoma cell line (CLBL-1) and 2 leukemia cell lines (CLBL70, GL1) were incubated with 3 ER agonists: DPN, PPT and estradiol. Cell viability was further assessed using propidium iodide and annexin V staining in flow cytometry. The next section describes the analogous analyses performed with 16 newly synthesized derivatives from estrone, estradiol and ethynylestradiol obtained in a biotransformation process based on the catalytic abilities of filamentous fungi of the genus Isaria fumosorosea cultures by the researchers at the The Faculty of Biotechnology and Food Science, University of Environmental and Life Sciences. The next two sections present the results of further research on 3 selected derivatives with the greatest cytotoxic potential and clinical utility: 17β-estradiol, Estriol, and 17α-estradiol. Propidium iodide and annexin V staining and cytometric analysis were performed for the above-mentioned compounds. The last, clinical part of the doctoral dissertation describes and presents the results of the ONCOFLOW project, which involves cytometric analysis of material collected by fine needle aspiration biopsy from 54 dogs in various veterinary facilities in Poland and Italy. All material was analyzed within 24 hours of collection using a standard diagnostic panel to determine the tumor phenotype. Additionally, recombinant antibody against estrogen receptor alpha [E115] (PE) was assessed on tumor cells in each sample. Based on FC results, cases were grouped into B-cell lymphomas (n=43), T-cell lymphomas (n=9), and acute lymphoblastic leukemias (n=2). The inclusion criteria for the study group were cytological/histological diagnosis by a pathologist, no previous treatment with steroids or cytostatic drugs, and provision of specific patient data. 32 cases were further assessed for sex and gender status. The results of the conducted research led to the following conclusions: unlike in humans, in dogs ERα is the dominant type of estrogen receptor expressed on hematopoietic cancer cells. Incubation of canine lymphoma/leukemia cells with non-selective and selective alpha estrogen receptor agonists inhibits tumor cell proliferation and induces apoptosis. 17-β-estradiol, estriol, 17α-ethynylestradiol and 17-α-estradiol are estrogen derivatives with the highest cytotoxic potential towards canine lymphoma and leukemia cells. Analysis of the data from the clinical part of the dissertation resulted in the following interpretations: different lymphoma subtypes differ in the level of ERα expression, with it predominating in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), as well as the level of ERα expression may be gender status-dependent.

status: finished

collation: 107