Germinação e criopreservação de embriões de Arecaceae: Butia eriospatha Mart. ex Drude Becc, Butia catarinensis Noblick & Lorenzi e Euterpe edulis Mart

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2023.

A Mata Atlântica abriga uma série de espécies de palmeiras (Arecaceae) ameaçadas, devido à perda e fragmentação de seus habitats, bem como por sua superexploração. Três delas, Butia eriospatha Mart. ex Drude Becc, Butia catarinensis Noblick & Lorenzi e Euterpe edulis Mart., nativas da Mata Atlântica do sul do Brasil, são amplamente conhecidas por sua importância ecológica e econômica. Estratégias de conservação ex situ fornecem um reservatório de diversidade genética protegido de ameaças antrópicas e ambientais. As sementes são uma das fontes de germoplasma preferidas e mais utilizadas para a conservação ex situ. No entanto, a sensibilidade à redução do conteúdo de água aliada a germinação baixa e lenta inviabiliza o armazenamento das sementes dessas espécies através de métodos convencionais. Técnicas de cultivo in vitro associadas à criopreservação possibilitam a preservação a longo prazo de germoplasma vegetal ameaçado. Buscou-se, no presente estudo, desenvolver métodos de germinação in vitro e de criopreservação para embriões excisados dessas três espécies de palmeiras ameaçadas. Embriões de sementes maduras foram dessecados em fluxo de ar laminar e passaram por testes de germinação in vitro. Definindo o limiar de dessecação, dois protocolos de criopreservação foram desenhados: embriões dessecados e imersos em nitrogênio líquido (NL); e embriões previamente dessecados, incubados em soluções de vitrificação de plantas (PVS2/PVS3) pelo método de vitrificação de gotículas. O estado bioquímico específico que tornou os embriões responsivos ao protocolo de criopreservação foi analisado para B. eriospatha. Alterações estruturais durante o processo de criopreservação foram descritas para B. catarinensis. A combinação de hormônios, antioxidantes e nutrientes permitiu que os embriões frescos se desenvolvessem em plântulas normais e foi eficaz na recuperação após a criopreservação. A redução do conteúdo de água até 0,14 gH2O gMS-1 e 0,13 gH2O gMS-1 não alterou significativamente a germinação de B. eriospatha (93,33%) e B. catarinensis (82,50%), porém ambas as espécies sofreram uma redução no índice de velocidade de germinação (IVG) de aproximadamente 60%. Em contraste, embriões de E. edulis mostraram-se mais sensíveis à dessecação, o limite crítico de conteúdo de água (CA) foi de 0,20 gH2O gMS-1 com germinação de 42,27% e redução do IVG em 32,23%, a perda total da viabilidade ocorreu em CA de 0,11 gH2O gMS-1. Durante a dessecação dos embriões de B. eriospatha houve um aumento significativo da poliamina PUT, o que resultou na redução da razão [(SPD+SPM) /PUT-1] MS). A intensa atividade de GPX e APX sugere que elas são as principais enzimas envolvidas na proteção celular durante a dessecação. O incremento no conteúdo de ácido glutâmico (Glu), leucina (Leu), lisina (Lys), glutamina (Gln), sugere suas ações como osmoprotetores. Em células meristemáticas de B. catarinensis a dessecação ocasionou invaginação das paredes celulares, retração da membrana plasmática e núcleos compactados. Ambas espécies sobreviveram a crioexposição, com taxas acima de 76% de formação de plântulas normais. Características de células viáveis, foram associadas à presença de mitocôndrias, núcleos intactos e paredes celulares preservadas. Por outro lado, 37,67% dos embriões de E. edulis dessecados até 0,20 gH2O gMS-1 e criopreservados sobreviveram, mas apenas 14,76% deles desenvolveram plântulas normais. O uso de PVS2 e PVS3 não incrementou os índices de sobrevivência para B. eriospata se mostrando ineficaz para embriões de E. edulis. Conclui-se que embriões de B. eriospatha e B. catarinensis tendem a se comportar de forma ortodoxa, tolerando baixa CC e congelamento e valida-se o método de dessecação parcial combinada com congelamento rápido, como estratégia de armazenamento a longo prazo para essas espécies. Para embriões de E. edulis o armazenamento através da criopreservação precisa ser adaptado e pesquisas adicionais das propriedades da água para uma melhor compreensão da vitrificação em altos CA ajudarão a otimizar os protocolos criopreservação para esta espécie.

Abstract: The Atlantic Forest is home to a number of endangered palm tree species (Arecaceae), due to the loss and fragmentation of their habitats, as well as their overexploitation. Three of them, Butia eriospatha (Mart. ex Drude) Becc, Butia catarinensis (Noblick & Lorenzi) and Euterpe edulis (Mart.), native to the Atlantic Forest of southern Brazil, widely known for their ecological and economic importance. Ex situ conservation strategies provide a reservoir of genetic diversity protected from anthropic and environmental threats. Seeds are one of the preferred and most used sources of germplasm for ex situ conservation. However, the sensitivity to the reduction of water content, combined with low and slow germination, prevents the storage of seeds from these species through conventional methods. The in vitro culture technique associated with cryopreservation provides a means for the long-term preservation of endangered plant material. Therefore, the aim of this study was to develop in vitro germination and cryopreservation methods for excised embryos from these three endangered palm species. For this purpose, mature seed embryos were desiccated in laminar airflow and underwent in vitro germination tests. Defining the desiccation threshold, two cryopreservation protocols were designed: embryos desiccated and immersed in liquid nitrogen (NL); and previously dried embryos, incubated in plant vitrification solutions (PVS2/PVS3) by the droplet vitrification method. The specific biochemical state that made the embryos responsive to the cryopreservation protocol was analyzed for B. eriospatha. Structural changes during the cryopreservation process have been described for B. catarinensis. The combination of hormones, antioxidants and nutrients allowed fresh embryos to develop into normal seedlings and was effective in recovering after cryopreservation. Reducing the water content to 0.14 gH2O gMS-1 and 0.13 gH2O gMS-1 did not significantly alter the germination of B. eriospatha (93.33%) and B. catarinensis (82.50%), but both the species suffered a reduction in the germination speed index (GVI) of approximately 60%. In contrast, E. edulis embryos were more sensitive to desiccation, the critical limit of water content (WC) was 0.20 gH2O gMS-1 with germination of 42.27% and reduction of IVG in 32.23 %, total loss of viability occurred at CA of 0.11 gH2O gMS-1. During desiccation of B. eriospatha embryos, there was a significant increase in PUT, which resulted in a reduction in the ratio [(SPD+SPM) /PUT-1] MS). The intense activity of GPX and APX led us to suggest that they are the main enzymes involved in cell protection during desiccation. And finally, the increase in the content of glutamic acid (Glu), leucine (Leu), lysine (Lys), glutamine (Gln), could be acting as osmoprotectors. In meristematic cells of B. catarinensis, desiccation caused invagination of the cell walls, retraction of the plasmatic membrane and compacted nuclei. Both species survived, survived cryoexposure, with rates above 76% of normal seedling formation. Characteristics of viable cells were associated with the presence of mitochondria, intact nuclei and preserved cell walls. On the other hand, 37.67% of E. edulis embryos desiccated to 0.20 gH2O gMS-1 and cryopreserved survived, but only 14.76% of them developed normal seedlings. The use of PVS2 and PVS3 did not increase survival rates for B. eriospata and were ineffective for E. edulis embryos. Therefore, it is concluded that B. eriospatha and B. catarinensis embryos tend to behave in an orthodox way, tolerating low WC and freezing, and the method of partial desiccation combined with rapid freezing is validated as a long-term storage strategy for these species. For E. edulis embryos storage via cryopreservation needs to be adapted, further research into the properties of water for a better understanding of vitrification at high WC will help to optimize cryopreservation protocols for this species.