Suscetibilidade de Aedes (Stegomya) aegypti (Diptera : Culicidae) ao malation utilizando bioensaios e expressão gênica

Orientador: Prof. Dr. Mario Antônio Navarro da Silva

Coorientadora: Dra. Angela Maria Palacio Cortés

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Entomologia). Defesa : Curitiba, 26/07/2021

Inclui referências: p.89-104

Resumo: O Aedes aegypti (Culicidae: Diptera) explora com sucesso o ecossistema urbano devido à antropofilia e é um vetor competente na transmissão de vírus para dengue, Zika, Chikungunya e febre amarela urbana levando a epidemias recorrentes. Quando medidas de monitoramento da atividade vetorial e redução de habitats para o desenvolvimento de imaturos falham, é necessário o uso de ferramentas como controle biológico e, por último, inseticidas para a redução da densidade populacional dos vetores. Este é um método limitado que apresenta toxicidade aos humanos e animais, leva à contaminação ambiental e seleciona os mosquitos resistentes ao princípio ativo. O monitoramento da resistência é realizado com o auxílio de técnicas como bioensaios e ferramentas moleculares, que auxiliam na determinação da suscetibilidade do vetor aos inseticidas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resistência de A. aegypti provenientes de Paranaguá (PR) utilizando a concentração discriminante (CD) estabelecida, bem como estudar a expressão gênica de enzimas relacionadas à resistência ao malation. Para isto, foi utilizado o método de bioensaios de suscetibilidade da OMS utilizando papéis impregnados com malation. A concentração discriminante foi estabelecida através de curva dose-resposta em concentrações entre 0,8 % e 3 % utilizando população suscetível Rockefeller mantida em insetário. A CD foi avaliada em mosquitos F2 procedentes de Paranaguá para obter o estado da resistência. A expressão gênica foi realizada após a transcrição reversa do RNA extraído de fêmeas sobreviventes à exposição na CD, fêmeas procedentes de campo sem exposição ao inseticida e fêmeas do insetário Rockefeller. Os genes estudados foram das enzimas acetilcolinesterase - AChE (ace-1), citocromo oxidase P450 (CYP6N12) e esterase B (CCEae3A) e os genes referência foram proteína ribossomal S17 e actina. A expressão gênica foi estimada utilizando o método 2-AACt. A CD estabelecida foi de 3,41 % e a população de Paranaguá apresentou 66,5 % de mortalidade, sendo considerada resistente. Os níveis de expressão gênica da AChE e esterase B não apresentaram diferença significativa entre o grupo resistente e os controles, mas houve aumento significativo na expressão da P450 no grupo resistente em relação ao controle não exposto. A CD obtida neste trabalho (3,41 %) foi superior à concentração recomendada pela OMS (0,8 %). A resistência ao malation foi evidenciada em uma população de A. aegypti de Paranaguá, apenas após três anos do uso deste inseticida e após a ocorrência de uma epidemia de dengue, que levou ao uso emergencial desta ferramenta. O aumento na expressão de um gene de P450 pode estar relacionado à sua função biológica na bioativação do malation nas fêmeas expostas. Embora não tenha sido detectada alteração na expressão de esterase B, não é descartada sua participação na resistência, uma vez que o mecanismo mais comum relacionado ao malation é o aumento desta enzima. A AChE, entretanto, parece não participar da resistência observada uma vez que não houve alteração da expressão gênica e mutações são raras em Aedes. O uso intensivo do malation em Paranaguá, após a ocorrência de uma epidemia, levou à seleção de resistência a este inseticida, evidenciado pelos resultados obtidos.

Abstract: Aedes aegypti (Culicidae: Diptera) successfully exploits the urban ecosystem due to anthropophilia and is a competent vector in the transmission of viruses for dengue, Zika, Chikungunya and urban yellow fever leading to recurrent epidemics. When measures to monitor vector activity and habitat reduction for immature development fail, it is necessary to use tools such as biological control and, finally, insecticides to reduce vector population density. This is a limited method that presents toxicity to humans and animals, leads to environmental contamination and selects mosquitoes resistant to the active ingredient. Resistance monitoring is carried out with the help of techniques such as bioassays and molecular tools, which help to determine the vector's susceptibility to insecticides. The objective of this work was to evaluate the resistance of A. aegypti from Paranaguá (PR) using the established discriminant concentration (CD), as well as to study the gene expression of enzymes related to resistance to malathion. For this, the WHO susceptibility bioassay method using malathion-impregnated papers was used. The discriminant concentration was established through a dose-response curve at concentrations between 0,8 % and 3 % using a susceptible Rockefeller population kept in an insectary. CD was evaluated in F2 mosquitoes from Paranaguá to obtain the resistance status. Gene expression was performed after reverse transcription of RNA extracted from females surviving CD exposure, females from the field without exposure to the insecticide and females from the Rockefeller insectary. The genes studied were the enzymes acetylcholinesterase - AChE (ace-1), cytochrome oxidase P450 (CYP6N12) and ? esterase (CCEae3A) and the reference genes were ribosomal protein S17 and actin. Gene expression was estimated using the 2-AACt method. The established DC was 3,41 % and the population of Paranaguá showed 66,5 % mortality, being considered resistant. The levels of gene expression of AChE and B esterase showed no significant difference between the resistant group and controls, but there was a significant increase in P450 expression in the resistant group compared to the unexposed control. The CD obtained in this work (3,41 %) was higher than the concentration recommended by the WHO (0,8 %). Malathion resistance was evidenced in a population of A. aegypti from Paranaguá, just three years after using this insecticide and after the occurrence of a dengue epidemic, which led to the emergency use of this tool. The increase in the expression of a P450 gene may be related to its biological role in the bioactivation of malathion in exposed females. Although no alteration in the expression of B esterase was detected, its participation in resistance is not discarded, since the most common mechanism related to malathion is the increase of this enzyme. AChE, however, does not seem to participate in the resistance observed since there was no change in gene expression and mutations are rare in Aedes. The intensive use of malathion in Paranaguá, after the occurrence of an epidemic, led to the selection of resistance to this insecticide, as evidenced by the results obtained.