Comparación de dos métodos de purificación de espermatozoides de toro para extracción de ARN total | Comparison of two methods for purification of bull spermatozoa for total RNA extraction

Spanish; Castilian. Objetivo. Comparar la eficacia de la purificación de espermatozoides por gradiente de densidad (GD) y por lisis de células somáticas (LCS) en semen bovino para obtener ARN total de alta calidad. Materiales y métodos. Se purificaron espermatozoides de 6 muestras seminales por GD y 6 por LCS. La pureza celular se verificó mediante qPCR de genes marcadores. La calidad y concentración de ARN por espermatozoide se determinaron por espectrofotometría, y la integridad del ARN se confirmó mediante la amplificación del gen PLCZ1 (fosfolipasa C zeta-1). Se realizó una prueba-t para para comparar calidad y concentración, considerando el método de purificación como factor fijo. Resultados. Ambos métodos resultaron eficientes, con buena amplificación de los genes marcadores a partir del ARN/cDNA de los espermatozoides purificados. Las concentraciones de ARN fueron 17.4±1.37 fg espermatozoide-1 (GD) y 38.7±9 (LCS), sin diferencias significativas (p>0.05). La calidad del ARN fue excelente en ambos métodos, con relaciones A260/A280 de 1.85±0.02 (GD) y 1.88±0.01 (LCS) y A260/A230 >2.0 ambos. Las 12 muestras amplificaron PLCZ1 (CT=32±1), con un coeficiente de variación del 0.78% entre réplicas. Conclusiones. Ambos métodos permiten la purificación específica de espermatozoides adecuados para medir expresión génica y pueden usarse según los recursos disponibles.

English. Objective. To compare the efficacy of sperm purification by density gradient (DG) and by somatic cell lysis (SCL) in bovine semen to obtain high-quality total RNA. Materials and methods. Spermatozoa were purified from 6 seminal samples using the DG method and 6 using the SCL method. The purity of the cells was verified through qPCR of marker genes. The quality and concentration of RNA per spermatozoon were determined using spectrophotometry, and RNA integrity was confirmed by amplification of the PLCZ1 gene (phospholipase C zeta-1). A t-test was performed to compare RNA quality and concentration, treating the purification method as a fixed factor. Results. Both methods demonstrated efficiency, yielding good amplification of marker genes from the purified spermatozoal RNA/cDNA. The RNA concentrations were 17.4±1.37 fg spermatozoon-1 (DG) and 38.7±9 fg spermatozoon-1 (SCL), with no significant differences observed (p>0.05). RNA quality was excellent with both methods, resulting in A260/A280 ratios of 1.85±0.02 (DG) and 1.88±0.01 (SCL), and A260/A230 >2.0 for both. All 12 samples amplified the PLCZ1 gene (CT=32±1), with a coefficient of variation of 0.78% between technical replicates. Conclusions. Both methods facilitate the specific purification of spermatozoa suitable for gene expression analysis and can be selected based on available resources.