Study of the biodiversity of lactic acid bacteria in Cognac distillation wines | Étude sur la biodiversité des bactéries lactiques dans les vins de distillation de Cognac

English. Oenococcus oeni is a lactic acid bacteria (LAB) species adapted to the challenging conditions of wine. Its specialization enables survival and proliferation in environments characterized by low pH and high ethanol levels, where most other bacteria cannot thrive. O. oeni plays a critical role in wine production by executing the malolactic fermentation (MLF) which follows the alcoholic fermentation (AF). During MLF, malic acid is converted into lactic acid, thereby softening the taste of wine. The genome of O. oeni mutates faster than that of other LAB species, primarily due to the absence of DNA mismatch repair genes. This high mutation rate is thought to have favored its adaptation to wine. The hundreds of strains sequenced to date form 4 genetic lineages adapted to different products: wine (lineage A), must and cider (lineages B and C), and kombucha (lineage D).Distillation wines from Cognac represent a specific ecological niche for O. oeni, due to their low pH, the non-utilization of sulfites, and the extended storage period following AF until distillation. This thesis aimed to explore the biodiversity of O. oeni and other LAB during their production. Genotyping of thousands of O. oeni isolates, genome sequencing of about 50 strains and qPCR analyses of the wines allowed us to identify a new genetic sub-lineage, named AC, which is predominant during MLF (Chapter 1).Phenotypic analyses revealed that AC strains exhibit superior growth in acidic conditions (pH 3.0) in Ugni blanc must, compared to commercial strains from lineage A. Furthermore, during MLF, AC strains influence the metabolic profile of wines differently, producing less ethyl lactate and consuming fewer residual sugars than A strains. Comparative genomics of the AC strains showed that they share some unique genes, such as α/β-fold hydrolase enzymes, biotin synthesis proteins, an arabinose-proton symporter and a D-xylose transporter, suggesting a specific sugar metabolism. Analyzing the distribution of exopolysaccharides genes further highlighted a specific genetic structure of AC strains compared to other A strains (Chapter 2).The population dynamics of O. oeni and LAB was monitored during wine storage from MLF to distillation by metabarcoding, phylogenomics, and qPCR. The persistence of O. oeni strains in cellars was also monitored over four consecutive vintages. Results showed that O. oeni remained the dominant species within the bacterial community during the conservation of Cognac wines. AC strains were usually the predominant strains throughout the storage period. AC strains were also the most persistent bacteria in cellars during several vintages (Chapter 3).Incidents of contaminations with Lactobacillus hilgardii, suggesting potential spoilage post-MLF, were observed in two wine samples. Given that distillation wines are produced without added sulfites, they are subject to bacterial spoilage during the long storage period that precedes distillation. The diversity of bacteria in spoiled Cognac wines was investigated by identification of species (MALDI-TOF MS, metabarcoding), and strain genotyping (MLVA, RAPD), revealing the presence of LAB species such as Lactobacillus paracasei, L. hilgardii, and O. oeni at different population levels. A pdu operon was identified for the first time in one of the sequenced O. oeni strains. This operon encodes genes for the conversion of glycerol into acrolein, which confers bitterness to the wine. A qPCR assay was developed for the early detection of bacteria in wine that carry this operon (Chapter 4).This study enriches our understanding of LAB biodiversity in Cognac distillation wines, particularly the biodiversity of the species O. oeni and its population dynamics, paving the way for future strategies aimed at improving the beneficial impact of O. oeni during MLF in these wines, and predicting and preventing their spoilage, thereby enhancing the quality of cognac.

French. Oenococcus oeni est une espèce de bactéries lactiques (BL) adaptée aux conditions difficiles du vin. Sa spécialisation lui permet de survivre et proliférer dans des environnements caractérisés par un pH acide et des teneurs en éthanol élevéesl, où la plupart des autres bactéries ne peuvent pas se développer. O. oeni joue un rôle crucial dans la production de vin en réalisant la fermentation malolactique (FML) qui suit la fermentation alcoolique (FA). Durant la MLF, l'acide malique est converti en acide lactique, ce qui adoucis le goût du vin. Le génome d'O. oeni mute plus rapidement que celui d'autres espèces de BL, en raison de l’absence de gènes de réparation de l’ADN mutS/L. Cette hyper-mutabilité pourrait avoir favorisé son adaptation au vin. Les centaines de souches séquencées à ce jour forment 4 lignées génétiques adaptées à différents produits : vin (lignée A), moût et cidre (lignées B et C), et kombucha (lignée D).Les vins de distillation de Cognac représentent une niche écologique spécifique pour O. oeni, en raison de leur pH bas, de la non-utilisation de sulfites, et de la période de stockage prolongée suivant la FA jusqu'à la distillation. Cette thèse visait à explorer la biodiversité d'O. oeni et des autres BL durant leur production. Le génotypage d'isolats d'O. oeni, le séquençage de génomes et la qPCR des vins nous ont permis d'identifier une nouvelle sous-lignée génétique, nommée AC, qui est prédominante durant la FML (Chapitre 1).Les analyses phénotypiques ont révélé que les souches AC ont une meilleure croissance en milieu acide (pH 3.0) que des souches commerciales de la lignée A. De plus, pendant la FML, les souches AC influencent différemment le métabolome des vins, produisant moins de lactate d'éthyle et consommant moins de sucres résiduels que les souches A. La génomique comparative a montré que les souches AC partagent certains gènes uniques qui suggèrent notamment un métabolisme spécifique du sucre. De plus, l'analyse de la distribution des gènes d'exopolysaccharides a mis en évidence une structure génétique spécifique des souches AC par rapport aux autres souches A (Chapitre 2).La dynamique des populations d'O. oeni et des BL a été étudiée durant le stockage du vin de la MLF à la distillation, par métabarcoding, phylogénomique et qPCR. La persistance des souches d'O. oeni dans les caves a également été suivie sur quatre millésimes. Les résultats ont montré qu'O. oeni restait l'espèce dominante au sein de la communauté bactérienne pendant la conservation des vins. Les souches AC étaient généralement les souches prédominantes tout au long de la conservation. Les souches AC étaient également les bactéries les plus persistantes dans les caves durant plusieurs millésimes (Chapitre 3).Dans la mesure où les vins de distillation sont produits sans sulfites ajoutés, ils sont sujets aux altérations bactériennes pendant leur conservation. La diversité des bactéries dans les vins de Cognac altérés par l’acroléine a été étudiée par identification des espèces (MALDI-TOF MS, metabarcoding), et des souches (MLVA et RAPD), révélant la présence d'espèces telles que Lactobacillus paracasei, L. hilgardii et O. oeni à différents niveaux de population. Un opéron pdu a été identifié pour la première fois chez une souche d'O. oeni. Cet opéron permet la conversion du glycérol en acroléine, qui confère un goût amer aux eaux-de-vie après distillation des vins. Un test de qPCR a été développé pour détecter les bactéries qui portent cet opéron dans les vins (Chapitre 4).Cette étude enrichit notre compréhension de la biodiversité des BL dans les vins de distillation de Cognac, en particulier la biodiversité de l'espèce O. oeni et sa dynamique de population, ouvrant la voie à de futures stratégies visant à améliorer l'impact bénéfique d'O. oeni durant la MLF dans ces vins, et à prédire et prévenir leur altération, améliorant ainsi la qualité du cognac.