A COMPLEX APPROACH TO THE ASSAY OF OXIDASE AND PEROXIDASE ACTIVITY OF THE SOLID-STATE CULTURE OF PLEUROTUS OSTREATUS HK-35 | КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ОКСИДАЗНОЙ И ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ТВЕРДОФАЗНОЙ КУЛЬТУРЫ PLEUROTUS OSTREATUS HK-35

English. The aim of this work is to develop the method to assay activity of laccase and peroxidase in plant and fungal extracts. We use laccase from Trametes versicolor and peroxidase from Armoracia rusticana as model enzymes to select the optimal conditions and to get the kinetic data by spectrophotometrical method. The approach was tested on assay the laccase and peroxidase activity in protein precipitate, isolated from aqueous extract of mycelial-sybstrate complex (solid-state culture) of Pleurotus ostreatus, strain HK-35. Meaning the different substrate specifity of isoenzymes in natural objects, use the different types of substrates (heterocyclic compounds, aromatic amines, phenols) improves reability of activity assay. Application of chemiluminescence to assay the enzymatic activity allows to work with mucous and highly colored samples, when spectrophotometry is difficult. In contrast to traditional luminol-depended chemiluminescent methods to peroxidase activity assay, the current study discover luminescence by oxidation the polyhidric phenols without activators. All used substrates except the phenol oxidise in presence of extracellular enzymes of strain HK-35, P. ostreatus. During oxidation of floroglucinol by these enzymes, as well as model enzymes take place chemiluminescence.

Russian. Цель работы – разработка методики определения лакказной и пероксидазной активности грибных и растительных экстрактов. Для подбора оптимальных условий и получения кинетических данных процесса окисления субстратов-маркеров с помощью спектрофотометрического и хемилюминесцентного методов использовали модельные ферменты – лакказу из Trametes versicolor (Трутовика разноцветного) и пероксидазу из Armoracia rusticana (Хрена обыкновенного). Апробацию разработанного подхода при определении лакказной и пероксидазной активности проводили на белковой смеси, выделенной из водного экстракта мицелиально-субстратного комплекса Pleurotus ostreatus (Вёшенки обыкновенной) HK-35. Использование субстратов-маркеров разной природы (гетероциклических соединений, ароматических аминов, фенолов) повышает надежность определения активности с учетом различной субстратной специфичности ферментов природных объектов. Применение хемилюминесцентного метода для анализа ферментативной активности позволяет работать с мутными и интенсивно окрашенными пробами, затрудняющими спектрофотометрию. В отличие от традиционных методик на основе люминол-зависимой хемилюминесценции в присутствии пероксидазы в работе исследовалось свечение, возникающее при окислении многоатомных фенолов. Все использованные субстраты, за исключением фенола, окисляются в присутствии внеклеточных ферментов P. оstreatus HK-35, однако их активность по сравнению с модельными очень мала. Окисление флороглюцина в присутствии внеклеточных ферментов P. оstreatus HK-35, так же, как и в присутствии модельных ферментов, сопровождается хемилюминесценцией.