Characterization of the tracrARN-DRARN genetic complex associated with the CRISPR-Cas9 system of the phytosymbiont Acholeplasma palmae: biotechnological interest | Caracterización del complejo genético tracrARN-DRARN asociado al sistema CRISPR-Cas9 del fitosimbionte Acholeplasma palmae descriptor: interés biotecnológico | Caracterização do complexo genético tracrARN-DRARN associado ao sistema CRISPR-Cas9 do descritor de Acholeplasma palmae fitossimbionte: interesse biotecnológico

English. The CRISPR-Cas9 technology used in plant biotechnology is based on the use of Cas9 endonucleases to generate precise cuts in the genome, and a duplex consisting of a trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) and a CRISPR RNA (DRRNA) which are precursors of guide RNA (sgRNA) commercially redesigned (sgRNA-Cas9) to guide gene cleavage. Most of these tools come from clinical bacteria. However, there are several CRISPR-Cas9 systems in environmental microorganisms such as phytoendosymbionts of plants of the genus Acholeplasma. But the exploitation of these systems more compatible with plants requires using bioinformatics tools for prediction and study. We identified and characterized the elements associated with the duplex in the genome of A. palmae. For this, the protein information was obtained from the Protein Data Bank and the genomics from GenBank/NCBI. The CRISPR system was studied with the CRISPRfinder software. Alignment algorithms and NUPACK software were used to identify the tracrRNA and DRRNA modules, together with various computational software for genetic, structural and biophysical characterization. A CRISPR-Cas system was found in A. palmae with type II-C characteristics, as well as a thermodynamically very stable duplex, with flexible regions, exhibiting a docking power with Cas9 thermodynamically favored. These results are desirable in programmable gene editing systems and show the possibility of exploring native molecular tools in environmental microorganisms applicable to the genetic manipulation of plants, as more research is carried out. This study represents the first report on the thermodynamic stability and molecular docking of elements associated with the tracrRNA-DRRNA duplex in the phytosymbiont A. palmae.

Spanish; Castilian. La tecnología CRISPR-Cas9 usada en biotecnología vegetal se fundamenta en el empleo de nucleasas Cas9 para generar cortes precisos en el genoma y un dúplex conformado por un trans-activador CRISPR ARN (tracrARN) y un CRISPR ARN (DRARN) los cuales son precursores del ARN guía (sgARN) rediseñado comercialmente (sgARN-Cas9) para guiar la escisión de genes. La mayoría de estas herramientas provienen de bacterias clínicas. Sin embargo, existen diversos sistemas CRISPR-Cas9 en microorganismos ambientales como los fitoendosimbiontes del género Acholeplasma. Pero la explotación de estos sistemas más compatibles con plantas requiere usar herramientas bioinformáticas para su predicción y estudio. Fueron identificados y caracterizados los elementos asociados al dúplex tracrARN-DRARN en A. palmae. Para ello la información proteica se obtuvo del Protein Data Bank y la genómica del GenBank/NCBI. El sistema CRISPR fue estudiado con el software CRISPRfinder. Se utilizaron algoritmos de alineamiento y el software NUPACK para identificar los módulos tracrARN y DRARN, y también diversos softwares computacionales para la caracterización genética, estructural y biofísica. Se encontró un sistema CRISPR-Cas en A. palmae con características de tipo II-C, así como un dúplex con regiones flexibles, termodinámicamente muy estable, presentando una energía de acoplamiento con Cas9 termodinámicamente favorecida. Estos resultados son deseables en sistemas de edición programable de genes y evidencian la posibilidad de explorar herramientas moleculares nativas en microorganismos ambientales aplicables a la manipulación genética de plantas, conforme se realicen más investigaciones. Este estudio representa el primer reporte sobre la estabilidad termodinámica y el acopamiento molecular de elementos asociados al dúplex tracrARN-DRARN en el fitosimbionte A. palmae.

Portuguese. A tecnologia CRISPR-Cas9 usada em biotecnologia vegetal é baseada no uso de nucleases Cas9 para gerar cortes precisos no genoma e um duplex composto de um RNA CRISPR transativador (tracrRNA) e um RNA CRISPR (DRARN) que são precursores de o RNA guia comercialmente reprojetado (sgRNA) (sgRNA-Cas9) para guiar a clivagem do gene. A maioria dessas ferramentas vem de bactérias clínicas. No entanto, existem vários sistemas CRISPR-Cas9 em microrganismos ambientais, como fitoendossimbiontes do gênero Acholeplasma. Mas a exploração desses sistemas mais compatíveis com as plantas requer o uso de ferramentas de bioinformática para sua previsão e estudo. Os elementos associados ao duplex tracrARN-DRARN em A. palmae foram identificados e caracterizados. Para isso, as informações sobre proteínas foram obtidas no Protein Data Bank e a genômica no GenBank / NCBI. O sistema CRISPR foi estudado com o software CRISPRfinder. Algoritmos de alinhamento e o software NUPACK foram utilizados para identificar os módulos tracrRNA e DRARN, além de diversos softwares computacionais para caracterização genética, estrutural e biofísica. Um sistema CRISPR-Cas foi encontrado em A. palmae com características do tipo II-C, bem como um duplex com regiões flexíveis, termodinamicamente muito estável, apresentando uma energia de acoplamento termodinamicamente favorecida com Cas9. Esses resultados são desejáveis em sistemas de edição de genes programáveis e mostram a possibilidade de explorar ferramentas moleculares nativas em microrganismos ambientais aplicáveis à manipulação genética de plantas, à medida que mais pesquisas são realizadas. Este estudo representa o primeiro relatório sobre a estabilidade termodinâmica e acoplamento molecular de elementos associados ao duplex tracrRNA-DRARN no fitossimbionte A. palmae.