Selección in vitro y caracterización de mutantes de Mycobacterium smegmatis resistentes a la capreomicina | In vitro selection and characterization of capreomycin-resistant Mycobacterium smegmatis mutants | Selecció in vitro i caracterització de mutants de Mycobacterium smegmatis resistents a la capreomicina

[ES] Mycobacterium tuberculosis es la principal especie causante de tuberculosis en humanos, una de las enfermedades más mortales a nivel global. En 2023, se estimaron 10,8 millones de casos nuevos de tuberculosis y 1,2 millones de muertes por la enfermedad. Además, más de una cuarta parte de las muertes globales causadas por bacterias resistentes a antibióticos son debidas a M. tuberculosis multidrogorresistente, siendo la tuberculosis una de las principales causas de muerte debido a resistencia antimicrobiana. La mayoría de los antibióticos que se utilizan en la práctica clínica tienen como diana el ribosoma. En este sentido, se ha postulado que la regulación de la traducción a nivel del ribosoma puede desempeñar un papel clave en la adaptación y, por ende, en la resistencia a antibióticos de M. tuberculosis, por lo que entender la mutabilidad del ribosoma podría facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para combatir la tuberculosis multidrogorresistente. M. smegmatis es un organismo no patógeno cercanamente relacionado con M. tuberculosis que se utiliza como modelo para estudiar la enfermedad. El presente Trabajo fin de grado se centra en la selección en condiciones de cultivo in vitro y en la caracterización de mutantes de M. smegmatis resistentes a la capreomicina, un antibiótico empleado para el tratamiento de la tuberculosis multidrogorresistente que tiene como diana el ribosoma, con el propósito de entender si se producen mutaciones en el ARN ribosomal que confieren resistencia a la capreomicina. Para ello, en primer lugar hemos creado la cepa SZ380 pTC12 de M. smegmatis, que contiene un gen reportero luminiscente para medir el efecto de la capreomicina en el crecimiento y en los niveles de traducción. Esta cepa se ha conseguido mediante la electroporación de un plásmido integrativo (pTC12) en la cepa de M. smegmatis SZ380, que contiene una sola copia del operón ribosomal de manera similar a M. tuberculosis. Esto nos ha permitido determinar la concentración mínima inhibitoria de la capreomicina en M. smegmatis. A continuación, hemos aislado clones resistentes a la capreomicina mediante crecimiento en medio sólido, con diferentes concentraciones de antibiótico, de la cepa creada. Finalmente, hemos secuenciado el ARN ribosomal de las colonias resistentes para detectar mutaciones implicadas en la resistencia. Los resultados de este trabajo proporcionarán un mejor entendimiento de la mutabilidad del ribosoma y de los mecanismos de resistencia antimicrobiana en M. tuberculosis y, por ello, podrían tener implicaciones significativas en el diseño de nuevos fármacos contra la tuberculosis multidrogorresistente.

[EN] Mycobacterium tuberculosis is the main species responsible for causing tuberculosis in humans, one of the deadliest diseases worldwide. In 2023, an estimated 10,8 million new cases of tuberculosis were reported, along with 1,25 million deaths caused by the disease. Furthermore, more than one tenth of global deaths due to antibiotic-resistant bacteria are attributed to multidrug-resistant M. tuberculosis, making tuberculosis one of the leading causes of death from antimicrobial resistance. Most antibiotics used in clinical practice target the ribosome. In this context, it has been proposed that translational regulation at the ribosomal level may play a key role in the adaptation and, consequently, in the antibiotic resistance of M. tuberculosis. Therefore, understanding ribosomal mutability could facilitate the development of new therapeutic strategies to combat multidrug-resistant tuberculosis. M. smegmatis is a non-pathogenic organism closely related to M. tuberculosis and it is used as a model to study the disease. Capreomycin is a ribosome-targeting antibiotic used to treat multidrug-resistant tuberculosis. This Final Degree Project focuses on the selection of M. smegmatis mutants resistant to capreomycin under in vitro culture conditions and their subsequent characterization, with the aim of understanding whether mutations occur in ribosomal RNA or other related genes that confer resistance to capreomycin. To this end, the M. smegmatis strain SZ380-pTC12 was created, which contains a luminescent reporter gene to measure the effect of capreomycin on translation levels. This strain was obtained by electroporating an integrative plasmid (pTC12) into the M. smegmatis SZ380 strain, which harbours a single copy of the ribosomal operon, similarly to M. tuberculosis. This enabled the determination of the minimum inhibitory concentration of capreomycin in M. smegmatis. Subsequently, capreomycin-resistant clones were isolated under in vitro growth conditions using different antibiotic concentrations. Ribosomal RNA and the gene orthologous to tlyA (a ribosomal RNA methyltransferase of M. tuberculosis) from the resistant colonies were sequenced to identify mutations involved in resistance. Finally, these colonies were characterized both structurally and phenotypically. The results from this study will provide a better understanding of ribosomal mutability and antimicrobial resistance mechanisms in M. tuberculosis, and may therefore have significant implications for the design of new drugs against multidrug-resistant tuberculosis.

Claydon Rojo, J. (2025). Selección in vitro y caracterización de mutantes de Mycobacterium smegmatis resistentes a la capreomicina. https://riunet.upv.es/handle/10251/224762

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