Propagação in vitro de Eucalyptus microcorys e metodologias para a investigação do rejuvenescimento e revigoramento de tecidos | In vitro propagation of Eucalyptus microcorys and methodologies for the investigation of tissue rejuvenation and reinvigoration

Most woody species experience morphological, physiological and biochemical changes during the transition from the juvenile to the adult phase, especially with regard to the potential for cloning, growth vigor and adventitious rooting of propagules. Due to the lack of studies that address the propagation of Eucalyptus microcorys, and to the difficulty in rescuing and cloning adult donor plants using non-destructive techniques, this thesis aimed to promote in vitro propagation of E. microcorys, and to investigate the rejuvenation and/or reinvigoration of tissues. In the first chapter, a protocol via micropropagation using a donor plant aged over 40 years was developed. In the second chapter, a micropropagation protocol through indirect organogenesis was developed to evaluate the interaction of plant growth regulators in juvenile tissues. In the third chapter, possible indications of rejuvenation and/or reinvigoration of tissues propagated by different techniques, were investigated. In overall terms, the protocol via micropropagation, using epicormic buds, were suitable for in vitro cultivation, presenting an establishment rate of 40.55%, and multiplication of 820 explants until the 11th subculture. In the elongating phase, the best results were observed in WPM media with 0.05 mg.L-1 of BAP + 1 mg.L-1 of NAA and 0.05 mg.L-1 of BAP + 1 mg.L-1 of NAA + 1 mg.L-1 of AIB. In the rooting and acclimatization phase two models of microvessels (M2 with volume = 2.6 cm3; and M3 with volume = 5.3 cm3) presented the best results, which formed normal adventitious roots and of direct connection with the vascular cambium. In the stages of the indirect organogenesis, the callogenesis averaged 81.38% of callus formation in explants. In the bud induction phase, the explants from the cotyledon presented the highest mean values, while in the elongating phase, the explants from the hypocotyl tissue presented the best results the evaluated characteristics. Regarding the rooting and acclimatization phase, three models of microvessels (M4 with volume = 2.6 cm3; M6 with volume = 5.3 cm3; and M7 with volume = 4.9 cm3) presented the best results, which formed normal adventitious roots directly connected to the vascular cambium. Through molecular tests, confirmed the successful cloning of plants resulting from the micropropagation protocol by the ISSR technique, and a low genetic diversity of the microplants of the indirect organogenesis protocol. The micropropagation protocol through indirect organogenesis was efficient for the production of E. microcorys microplants, which requires as an explant the hypocotyl tissue grown in culture medium supplemented with 1 mg.L -1 TDZ, 1 mg.L -1 TDZ + 4 mg.L -1 NAA or 3 mg.L -1 TDZ + 2 mg.L -1 NAA. In the investigation of possible indications of rejuvenation and/or reinvigoration of tissues, materials resulting from plant production techniques were used: the seminal, grafting, micropropagation with epicormic shoots and indirect organogenesis. It was concluded that the individuals propagated via grafting presented different results with the other propagation techniques, but their behavior possibly does not match with greater rejuvenation and/or reinvigoration of the tissues. By the total protein test (TCA/Acetone/Phenol) two distinct regions were found in the samples obtained by grafting. The highest enzymatic activity of the peroxidase test was observed in the sample via micropropagation by epicormic shoots, demonstrating an indication of tissue rejuvenation. Regarding by pXRF, the best responses were detected for the distinction of materials propagated from the elements K, Ca, Zn, Fe, Mn, Si. However, new studies are recommended in order to seek other methods that have similarities with the responses to rooting in forest species and thus optimize the rescue in materials with different ontogenetic stages.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

A maioria das espécies lenhosas apresentam mudanças morfológicas, fisiológicas e bioquímicas durante a transição da fase juvenil para a adulta, principalmente no potencial de clonagem, vigor de crescimento e enraizamento adventício. A partir da premissa que há poucos estudos que abordam a propagação de Eucalyptus microcorys, e pela dificuldade do resgate e clonagem de matrizes adultas por meio de técnicas não-destrutivas, a tese foi dividida em três seções, tendo por objetivo geral promover a propagação in vitro de E. microcorys e investigar o rejuvenescimento e/ou revigoramento de tecidos. O primeiro capítulo baseou-se em desenvolver um protocolo via micropropagação utilizando matriz com idade superior a 40 anos. O segundo capítulo foi baseado em desenvolver um protocolo de micropropagação por meio da organogênese indireta, avaliando a interação de fito-reguladores de crescimento em tecidos juvenis. O terceiro capítulo baseou-se em investigar possíveis indicativos do rejuvenescimento e/ou revigoramento de tecidos por meio de diferentes técnicas de produção de mudas. Em termos gerais, o protocolo via micropropagação utilizando brotos epícórmicos apresentou aptidão para o cultivo in vitro com estabelecimento de 40,55%, e multiplicação de 820 explantes até o 11° subcultivo. Na fase de alongamento os melhores resultados foram observados na suplementação do meio de cultura com 0,05 mg.L-1 de BAP + 1 mg.L-1 de ANA e com 0,05 mg.L-1 de BAP + 1 mg.L-1 de ANA + 1 mg.L-1 de AIB. Na fase de enraizamento e aclimatização, destacaram-se dois modelos de microtubetes (M2 com volume = 2,6 cm3; e M3 com volume = 5,3 cm3), formando raízes adventícias normais e de conexão direta com o câmbio vascular. Nas etapas da organogênese indireta, a calogênese apresentou média de 81,38% de formação de calos nos explantes. Na fase de indução de gemas, os explantes do cotilédone apresentaram os maiores valores médios, enquanto na fase de alongamento os explantes do hipocótilo apresentaram os melhores resultados para as características avaliadas. Com relação a fase de enraizamento e aclimatização, destacaram-se três modelos de microtubetes (M4 com volume = 2,6 cm3; M6 com volume = 5,3 cm3; e M7 com volume = 4,9 cm3), formando raízes adventícias normais e de conexão direta com o câmbio vascular. Por meio dos testes moleculares pela técnica de ISSR, foi possível confirmar a clonagem das plantas resultantes do protocolo de micropropagação e detectou-se baixa diversidade genética das plantas do protocolo da organogênese indireta. O protocolo de micropropagação por meio da organogênese indireta foi eficiente, sendo a melhor resposta observada com o explante do hipocótilo em meio de cultura com 1 mg.L -1 de TDZ, 1 mg.L -1 de TDZ + 4 mg.L -1 de ANA ou 3 mg.L -1 de TDZ + 2 mg.L -1 de ANA. Na investigação de indicativos do rejuvenescimento e/ou revigoramento de tecidos, foram utilizados os materiais resultantes das técnicas de produção de mudas via seminal, via enxertia, via micropropagação com brotações epicórmicas e via organogênese indireta. Verificou-se que os indivíduos propagados via enxertia apresentaram resultados diferenciados com as demais técnicas de propagação, mas seu comportamento, possivelmente, não condiz com maior rejuvenescimento e/ou revigoramento dos tecidos. Pelo teste de proteínas totais (TCA/Acetona/Fenol) verificou-se duas regiões distintas nas amostras obtidas pela enxertia. A maior atividade enzimática do teste de peroxidase foi observada na amostra via micropropagação por brotos epicórmicos, demonstrando um indicativo do rejuvenescimento de tecidos. Com relação ao pXRF, foram detectadas as melhores respostas para a distinção dos materiais pelos elementos K, Ca, Zn, Fe, Mn, Si. Contudo, novos estudos são recomendados a fim de buscar outros métodos que apresentem similaridades com as respostas ao enraizamento em espécies florestais e assim otimizar o resgate e clonagem de plantas com distintos estágios ontogenéticos.