Este trabalho avaliou o desenvolvimento in vitro e in vivo de mórulas de camundongos congeladas por diferentes métodos. A congelação lenta foi realizada em 1,5M de etileno glicol (EG) sendo os embriões resfriados a 0,5; 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto. Na vitrificação, as mórulas foram equilibradas por 3 minutos em 20% de EG e vitrificadas em solução contendo 40% de EG, 18% de ficol e 10,26% de sacarose após 60 segundos de exposição. A congelação rápida em vapor de nitrogênio foi realizada em solução contendo 3M de EG + 0,3M de sacarose após 2 ou 5 minutos de exposição. Os embriões dos três métodos foram descongelados pela exposição das palhetas ao ar por 10 segundos e imersão em água a 25ºC por 20 segundos. Todos os embriões descongelados foram cultivados in vitro por 72 horas para avaliação da sobrevivência in vitro. Para avaliação da sobrevivência in vivo, mórulas congeladas e não congeladas (controle) foram transferidas para receptoras. O desenvolvimento in vitro nas velocidades de 0,5; 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto foi, respectivamente, 72,3; 79,6; 76,5 e 84,8%. Não houve diferença estatística entre as velocidades de 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto (p >; 0,01). O desenvolvimento in vitro das mórulas congeladas por vitrificação e pelo método rápido (84,5 e 74,3%, respectivamente) foi semelhante ao método lento. In vivo, a taxa de implantação e o número de fetos vivos não diferiram estatisticamente entre os grupos lento a 1,2ºC/minute, vitrificação e rápido. | The in vitro and in vivo development of mouse morulae after cryopreservation through different methods was examined. The slow-freezing involved an equilibration in 1.5M ethylene glycol (EG) and cooled at 0.5; 0.7; 1.0 or 1.2ºC/minute. The vitrification involved a 3 minutes equilibration in 20% EG and 60 seconds in solution containing 40% EG, 18% ficoll and 10.26% sucrose. The quick-freezing involved an equilibration in 3M EG + 0.3M sucrose for 5 minutes and 2 minutes in nitrogen vapor. In all three methods the straws were thawed in air for 10 seconds and in water at 25ºC for 20 seconds and the embryos cultured in vitro for 72 hours to estimate blastocyst rate. To assess viability in vivo, frozen morulae as well as fresh embryos were transferred into recipients. The in vitro development rates with 0.5, 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute were, respectively, 72.3; 79.6; 76.5 and 84.8%. There was no significant difference among the cooling rates of 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute (p >; 0.01). The in vitro survival rates of vitrification and quick-freezing (84.5 and 74.3%, respectively) were similar to the slow-freezing. In vivo, the implantation rate and number of fetuses from embryos frozen through slow-freezing at 1.2ºC/minute, vitrification and quick-freezing were not significantly different.

The effects of plunging temperature in liquid nitrogen and cryoprotectant dilution methods were evaluated for compacted mouse morulae frozen in 1.5 M ethylene-glycol (E), 1.5M propylene-glycol (P) or 1.4M glycerol (G). Morulae were equilibrated for 10 minutes in cryoprotectant solution and loaded into 0.25 ml straws with cryoprotectant solution in 3 columns (groups E1, P1, G1) or cryoprotectant in the center and PBS in the lateral columns (E2, P2). Straws were cooled at 0.5ºC/min to -25 or -30ºC and plunged into liquid nitrogen. Straws were thawed in water at 22ºC for 20 seconds. Cryoprotectant was diluted in 3 steps for group G1 and in one step for groups E1 and P1 (direct transfer to PBS + 10% FCS) and E2 and P2 (shaken to mix the 3 columns before transferring to PBS+ 10% FCS). Plunging temperature had no significant effect on the proportion of morulae developed to blastocysts in vitro; this proportion was higher (p < 0.0001) in E1 (69.2%) than in E2 (60.3%), G1 (51.9%) and combined for P1 and P2 (46.9%). In second experiment, the proportion of transferred morulae that developed to viable fetuses was lower (p < 0.07) for E1-25 than for E1-30, G1-30, E2-25 or unfrozen (control) embryos (8.7, 20.0, 20.0, 17.4 and 19.8%, respectively). In conclusion, the ethylene glycol diluted directly in PBS (E1) exhibit the highest rate of in vitro embryos development, but based on in vivo embryos development was more efficacious in plunging temperature at -30ºC (E1-30). | Os efeitos das temperaturas de imersão em nitrogênio líquido e dos métodos de remoção dos crioprotetores foram avaliados em mórulas de camundongos congeladas em etilenoglicol (E), propilenoglicol (P) e glicerol (G). Os embriões foram equilibrados em E (1,5M), P (1,5M) ou G (1,4M) por 10 minutos e envasados em palhetas de 0,25 ml com crioprotetor nas três colunas (E1, P1 G1) ou PBS nas colunas das extremidades (E2, P2). As palhetas foram resfriadas a 0,5ºC/minuto até -25 ou -30ºC e imersas em nitrogênio líquido. A descongelação dos embriões foi feita em água a 22ºC por 20 segundos. O crioprotetor dos embriões congelados em glicerol (Gl) foi removido em 3 etapas, dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com crioprotetor nas 3 colunas (El e Pl) removido diretamente em PBS e dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com PBS nas colunas das extremidades (E2, P2), após mistura das três colunas dentro da palheta, em PBS. Não houve influência da temperatura de imersão sobre o desenvolvimento embrionário in vitro, observando maior taxa (p < 0,0001) para El (69,2%) que para E2 (60,3%), Gl (51,9%) e a combinação P1 e P2 (46,9%). Para o desenvolvimento in vivo, a taxa de fetos foi menor (p < 0,07) para o grupo E1-25 do que para o Controle; Gl-30ºC; El-30ºC e E2-25ºC. Pode-se concluir que in vitro o melhor crioprotetor foi o etilenoglicol com remoção direta em PBS e que in vivo o etilenoglicol e o glicerol foram semelhantes a -30ºC.

Compacted mouse morulae were frozen at 0.3ºC/min. or 0.5ºC/min. from -6ºC to -24ºC or -32ºC in 10% of glycerol plus different sucrose concentrations with or without 0.1% of honeybee royal jelly. Embryos were thawed in water bath at 22ºC for 20 seconds and cryoprotectant dilution was done in three steps. Embryos were cultured in Whitten’s medium for 24, 48 and 72 hours at 37ºC, 5% of CO2 and 100% of humidity. The in vitro development ranged from 56.6% to 100% after 72 hours. Expanded blastocysts were transferred to pseudopregnant recipients on the third day of the estrous cycle. Viable fetuses rates for embryos frozen to -24 or -32ºC at 0.3ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose, 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly, 10% glycerol + 0.1% honeybee royal jelly or 10% glycerol were respectively: 28.1% and 13.6%, 48.7% and 31.9%, 28.6% and 13.2%, 20.0% and 42.4%. Viable fetuses for embryos frozen to -24ºC or -32ºC at 0.5ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose or 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly were respectively 29.0% and 15.3%, 48.8% and 32.0%. We can conclude that addition of 10% sucrose to 10% glycerol was efficient for embryo freezing at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC. The honeybee royal jelly addition provided higher viable fetuses rates when embryos were cooled at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC. | Embriões de camundongos foram congelados em 10% de glicerol adicionado de várias concentrações de sacarose e/ou 0,1% de geléia real, nas velocidades de 0,3ºC ou 0,5ºC/minuto até -24ºC ou -32ºC e descongelados em água a 22ºC durante 20 segundos. A diluição dos crioprotetores foi realizada em três etapas e o cultivo dos embriões no meio de Whitten em estufa com 5% de CO2, 100% de umidade e 37ºC por 72 horas. O desenvolvimento in vitro até blastocisto variou entre 56,6% e 93,4%, mostrando que 10% de sacarose + 10% de glicerol foi eficiente na congelação. Blastocistos expandidos oriundos de embriões congelados até -24 ou -32ºC à velocidade de 0,3ºC/minuto em soluções contendo 10% de glicerol + 10% de sacarose; 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real; 10% de glicerol + 0,1% de geléia real ou 10% de glicerol, transferidos para receptoras pseudoprenhes, apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 28,1% e 13,6%, 48,7% e 31,9%, 28,6% e 13,2%, 20,0% e 42,4%. Embriões congelados até -24ºC ou -32ºC a 0,5ºC/minuto nas soluções de 10% de glicerol + 10% de sacarose ou 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 29,0% e 15,3%, 48,8% e 32,0%. Adição de sacarose e de geléia real ao meio de congelação contendo 10% de glicerol proporcionou maiores taxas de fetos viáveis a 0,3ºC e 0,5ºC/minuto e imersão em nitrogênio líquido a -24ºC.