Мета. Введення в культуру in vitro та одержання калюсів із зрілих зародків 3 зразків пшениці спельти та порівняння ефективності їхнього калюсогенезу із 2 зразками пшениці м’якої. Методи. Для проведення цього дослідження було обрано 5 зразків гексаплоїдної пшениці: 3 – спельти та 2 – пшениці м’якої. Стерилізацію зерна проводили 96% етиловим спиртом та 5% розчином гіпохлориту натрію. Для уведення в культуру in vitro експлантами брали зрілі зародки. Для калюсогенезу використали три типи живильних середовищ Мурасіге і Скуга (МS) з різним компонентним складом. Експланти культивували в темряві 21 добу. Результати. Підібрано оптимальні умови для індукції культури тканин Triticum spelta L. та T. aestivum L. із зрілих зародків. Отримані з різних зразків калюси, які вирощували на трьох типах модифікованого живильного середовища МS, не відрізнялись між собою морфологічно. У сортів спельти ‘Європа’ і пшениці м’якої ‘Бунчук’ та ‘Елегія Миронівська’ незалежно від складу середовища спостерігали високу ефективність калюсоутворення, у той час як на експлантах спельти сорту ‘Зоря України’ відбувалось повільне формування калюсу.Висновки. З експлантів зрілих зародків отримано культуру тканин 3 зразків спельти та 2 зразків пшениці м’якої. Встановлено, що найефективнішими для калюсоутворення з експлантів зрілих зародків пшениці м’якої та спельти було живильне середовище MS з 3% сахарози, доповнене 2 мг/л 2,4-Д, 10 мл/л арґентумом нітрату. Ефективність калюсогенезу на 21 добу культивування, залежно від зразка, варіювала в межах 80,2–100,0%. Досліджувані зразки відрізнялись між собою за здатністю формувати калюси на живильних середовищах із різним компонентним складом. | Purpose. Introduction to in vitro culture and obtaining of callus from mature embryos of 3 spelt samples and comparing the effectiveness of their callusogenesis with 2 soft wheat samples. Methods. Five samples of hexaploid wheat (three of spelt and two of soft wheat) were taken for experiments. Surface sterilization of grains was carried out in 96% ethanol and 5% sodium hypochlorite solution. Mature embryos were used as explants. Three types of MS culture media with different component compositions were used for callusogenesis. Explants were cultivated in the dark for 21 days. Results. The optimal conditions for the induction of tissue culture of Triticum spelta L. and T. aestivum L. from mature embryos were selected. Received calli from different samples, which were grown on three types of culture media MS, did not differ morphologically from each other. A genetic predisposition to callus formation was observed for specimens of ‘Evropa’ spelt variety and soft wheat ‘Bunchuk’ and ‘Elehiia Myronivska’ wheat samples regardless of the composition of the MS medium, while callus formation was slow on the explants of ‘Zoria Ukrainy’ cultivar. Conclusions. A tissue culture of 3 spelt samples and 2 soft wheat samples was obtained using mature embryos as explants. It was found that a nutrient medium containing 3% sucrose and supplemented with 2 mg/L 2,4-D, 10 ml/L silver nitrate was the most effective for callus formation from mature germ explants of soft wheat and spelt. The efficiency of the calluso­genesis on the 21st day of cultivation, depending on the sample, varied in the range of 80.2–100.0%. The studied samples differed among themselves in their ability to form calli on nutrient media with different component composition. The efficiency of spelt callusogenesis was first studied in Ukraine. | Цель. Введение в культуру in vitro и получение каллюса от зрелых зародышей 3 образцов спельты и сравнение эффективности их каллюсогенеза с 2 образцами пшеницы мягкой. Методы. Для работы взяты 5 образцов гексаплоидной пшеницы – 3 спельты и 2 пшеницы мягкой. Поверхностную стерилизацию зерна проводили в 96% этиловом спирте и 5% растворе гипохлорита натрия. В качестве эксплантов использовализрелые зародыши. Для калюсогенеза использовали три типа питательных сред МS с различным компонентным составом. Экспланты культивировали в темноте 21 день. Результаты. Подобраны оптимальные условия для индукции культуры тканей Triticum spelta L. и T. aestivum L. из зрелых зародышей. Полученные каллюсы из разных образцов, которые выращивали на трех типах питательных сред МS, не отличались между собой морфологически. Наблюдали генетическую предрасположенность к каллюсообразованию образцов спельты сорта ‘Європа’ и пшеницы мягкой сортов ‘Бунчук’ и ‘Елегія Миронівська’ независимо от состава среды MS в то время, как на эксплантах спельты сорта ‘Зоря України’ происходило медленное формирование каллюса. Выводы. Получено культуру тканей 3 образцов спельты и 2 образцов пшеницы мягкой с использованием в качестве эксплантов зрелых зародышей. Установлено, что наиболее эффективной для каллюсообразования из эксплантов зрелых зародышей пшеницы мягкой и спельты была питательная среда, дополненная 2 мг/л 2,4-Д, 10 мл/л нитрата серебра и содержащая 3% сахарозы. Среднее значение эффективности каллюсогенеза при этом составляло 80,2–100,0% на 21 сутки выращивания. Исследуемые образцы отличались между собой способностью формировать каллюс на питательных средах с различным компонентным составом. Впервые в Украине исследована эфективность каллюсогенеза спельты.

Purpose. To study the expression of gus and gfp genes in callus explants of amphidiploid spelt wheat (Triticum spelta L.) after Agrobacterium-mediated genetic transformation.Methods. Winter spelt wheat of ‘Europa’ variety was chosen for transformation. Calli obtained from mature embryos were used as explants. Callus pre-cultivation was carried out on MS nutrient medium (Murashige–Skoog) supplemented with 2 mg/L 2.4-D (2.4-Dichlorophenoxyacetic acid) and 10 mg/L silver nitrate. For genetic transformation, Agrobacterium tumefaciens Conn., strain GV3101 and a genetic construct with reporter genes beta-glucuronidase (GUS) and green fluorescent protein (GFP) were used. Calli were transformed by inoculation with agrobacteria and vacuum infiltration. Then they were co-cultured on MS medium with 2 mg/L 2.4-D and 10 mg/L AgNO3, but without antibiotics. The expression of the gus gene was checked by histochemical and the gfp gene by visual analysis (fluorescence of the GFP protein in UV light). Gfp and gus gene expression levels were evaluated using ImajeJ software. The integration of the gfp and gus genes into the spelt genome was verified by PCR.Results. Genetic transformation of spelt callus explants by inoculation in a nutrient medium with agrobacteria and vacuum infiltration occurred at different frequencies. The level of expression of the gus gene during vacuum infiltration was 4.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.00 ± 0.91%; and the gfp gene with vacuum infiltration – 3.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.66 ± 1.39%. The level of expression of the gfp gene was higher when using inoculation with agrobacteria, and the gus gene was higher during vacuum infiltration. Using PCR analysis, the integration of the gfp and gus genes into the callus of spelt genome was confirmed. The length of the PCR product with primers for the gus gene was 240 bp, and 717 bp for the gfp gene.Conclusions. The use of vacuum infiltration and inoculation methods for spelt genetic transformation gave different results. The frequency of genetic transformation ranged from 3.66 to 4.66%. Agrobacterium-mediated genetic transformation of amphidiploid spelt wheat allows us to study the expression of gus and gfp reporter genes using callus explants derived from mature embryos | Цель. Исследовать экспрессию генов gus и gfp в каллюсных эксплантах амфидиплоидной пшеницы спельты (Triticum spelta L.) после Agrobacterium-опосредованной генетической трансформации. Методы. Для трансформации был выбран сорт пшеницы спельты озимой ‘Европа’. В качестве эксплантов использовали каллюсы, полученные из зрелых зародышей. Для прекультивации каллюсов использовали питательную среду МС (Мурасиге–Скуга), дополненную 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 10 мг/л нитратом серебра. Для генетической трансформации использовали Agrobacterium tumefaciens Conn., штамм GV3101, и генетическую конструкцию, содержащую репортерные гены gus (ген бета-глюкуронидазы) и gfp (ген зеленого флюоресцентного белка GFP). Каллюсы трансформировали путем инокуляции с агробактериями и вакуумной инфильтрацией. Далее их ко-культивировали на среде МС с 2 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNO3, но без антибиотиков. Экспрессию гена gus проверяли с помощью гисто­химического анализа, а гена gfp – визуального (флуоресценция белка GFP в UV свете). Уровни экспрессии генов gfp и gus оценивали с помощью программного обеспечения ImajeJ. Интеграцию генов gfp и gus в геном спельты проверяли методом ПЦР. Результаты. Генетическая трансформация каллюсных эксплантов спельты путём их инокуляции в питательной среде с агробактериями и вакуумной инфильтрацией происходила с разной частотой. Уровень экспрессии гена gus при вакуумной инфильтрации составил 4,66 ± 0,74%, а при инокуляции – 4,00 ± 0,91%, а гена gfp при вакуумной инфильтрации – 3,66 ± 0,74%, а при инокуляции – 4,66 ± 1,39%. Уровень экспресии гена gfp был выше в случае использования инокуляции с агробактериями, а гена gus – при вакуумной инфильтрации. При помощи ПЦР анализа была подтверждена интеграция генов gfp и gus в геном каллюсов спельты. Длина ПЦР продукта с праймерами к гену gus составила 240 п. н., а для гена gfp – 717 п. н. Выводы. Использование методов вакуумной инфильтрации и инокуляции для генетической трансформации спельты дали разные результаты. Частота генетической трансформации колебалась от 3,66 до 4,66%. Agrobacterium-опосредованная генетическая трансформация амфидиплоидной пшеницы спельты позволяет исследовать экспрессию репортерных генов gus и gfp при использовании каллюсных эксплантов, полученных из зрелых зародышей. | Мета. Дослідити експресію генів gus та gfp в калюсних експлантах амфідиплоїдної пшениці спельти (Triticum spelta L.) після Agrobacterium-опосередкованої генетичної трансформації. Методи. Для трансформації було обрано сорт пшениці спельти озимої ‘Європа’. Як експланти використовували калюси, отримані зі зрілих зародків. Прекультивацію калюсів здійснювали на живильному середовищі МС (Мурасіге–Скуга), доповненому 2 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота) та 10 мг/л нітратом срібла. Для генетичної трансформації використовували Agrobacterium tumefaciens Conn., штам GV3101, та генетичну конструкцію з репортерними генами gus (ген бета-глюкуронідази (-glucuronidase)) та gfp (ген зеленого флюоресцентного білка (Green Fluorescent Protein, GFP)). Калюси трансформували шляхом інокуляції з агробактеріями та вакуумною інфільтрацією. Далі їх ко-культивували на середовищі МС із 2 мг/л 2,4-Д та 10 мг/л AgNO3, але без антибіотиків. Експресію гена gus перевіряли за допомогою гістохімічного, а гена gfp – візуального аналізу (флуоресценція білка GFP в УФ світлі). Рівні експресії генів gfp та gus оцінювали за допомогою програмного забезпечення ImajeJ. Інтеграцію генів gfp та gus в геном спельти перевіряли методом ПЛР.Результати. Генетична трансформація калюсних експлан­тів спельти шляхом їхньої інокуляції в живильному середовищі з агробактеріями та вакуумною інфільтрацією відбувалась з різною частотою. Рівень експресії гена gus за вакуумної інфільтрації становив 4,66 ± 0,74%, за інокуляції – 4,00 ± 0,91%; а гена gfp за вакуумної інфільтрації – 3,66 ± 0,74%, за інокуляції – 4,66 ± 1,39%. Рівень експресії гена gfp був вищим у разі використання інокуляції з агробактеріями, а гена gus – при ва­ку­умній інфільтрації. За допомогою ПЛР-аналізу було під­тверджено інтеграцію генів gfp та gus в геном калюсів спельти. Довжина ПЛР продукту із праймерами до гена gus становила 240 п. н., а до гена gfp – 717 п. н.Висновки. Використання методів вакуумної інфільтрації та інокуляції для генетичної трансформації спельти дали різні результати. Частота генетичної трансформації коливалась від 3,66 до 4,66%. Agrobacterium-опосередкована генетична трансформація амфідиплоїдної пшениці спельти дозволяє дослідити експресію репортерних генів gus та gfp за використання калюсних експлантів, отриманих із зрілих зародків.

Purpose. To study the expression of gus and gfp genes in callus explants of amphidiploid spelt wheat (Triticum spelta L.) after Agrobacterium-mediated genetic transformation. Methods. Winter spelt wheat of ‘Europa’ variety was chosen for transformation. Calli obtained from mature embryos were used as explants. Callus pre-cultivation was carried out on MS nutrient medium (Murashige–Skoog) supplemented with 2 mg/L 2.4-D (2.4-Dichlorophenoxyacetic acid) and 10 mg/L silver nitrate. For genetic transformation, Agrobacterium tumefaciens Conn., strain GV3101 and a genetic construct with reporter genes beta-glucuronidase (GUS) and green fluorescent protein (GFP) were used. Calli were transformed by inoculation with agrobacteria and vacuum infiltration. Then they were co-cultured on MS medium with 2 mg/L 2.4-D and 10 mg/L AgNO3, but without antibiotics. The expression of the gus gene was checked by histochemical and the gfp gene by visual analysis (fluorescence of the GFP protein in UV light). Gfp and gus gene expression levels were evaluated using ImajeJ software. The integration of the gfp and gus genes into the spelt genome was verified by PCR. Results. Genetic transformation of spelt callus explants by inoculation in a nutrient medium with agrobacteria and vacuum infiltration occurred at different frequencies. The level of expression of the gus gene during vacuum infiltration was 4.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.00 ± 0.91%; and the gfp gene with vacuum infiltration – 3.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.66 ± 1.39%. The level of expression of the gfp gene was higher when using inoculation with agrobacteria, and the gus gene was higher during vacuum infiltration. Using PCR analysis, the integration of the gfp and gus genes into the callus of spelt genome was confirmed. The length of the PCR product with primers for the gus gene was 240 bp, and 717 bp for the gfp gene. Conclusions. The use of vacuum infiltration and inoculation methods for spelt genetic transformation gave different results. The frequency of genetic transformation ranged from 3.66 to 4.66%. Agrobacterium-mediated genetic transformation of amphidiploid spelt wheat allows us to study the expression of gus and gfp reporter genes using callus explants derived from mature embryos

Purpose. To study the expression of gus and gfp genes in callus explants of amphidiploid spelt wheat (Triticum spelta L.) after Agrobacterium-mediated genetic transformation. Methods. Winter spelt wheat of ‘Europa’ variety was chosen for transformation. Calli obtained from mature embryos were used as explants. Callus pre-cultivation was carried out on MS nutrient medium (Murashige–Skoog) supplemented with 2 mg/L 2.4-D (2.4-Dichlorophenoxyacetic acid) and 10 mg/L silver nitrate. For genetic transformation, Agrobacterium tumefaciens Conn., strain GV3101 and a genetic construct with reporter genes beta-glucuronidase (GUS) and green fluorescent protein (GFP) were used. Calli were transformed by inoculation with agrobacteria and vacuum infiltration. Then they were co-cultured on MS medium with 2 mg/L 2.4-D and 10 mg/L AgNO3, but without antibiotics. The expression of the gus gene was checked by histochemical and the gfp gene by visual analysis (fluorescence of the GFP protein in UV light). Gfp and gus gene expression levels were evaluated using ImajeJ software. The integration of the gfp and gus genes into the spelt genome was verified by PCR. Results. Genetic transformation of spelt callus explants by inoculation in a nutrient medium with agrobacteria and vacuum infiltration occurred at different frequencies. The level of expression of the gus gene during vacuum infiltration was 4.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.00 ± 0.91%; and the gfp gene with vacuum infiltration – 3.66 ± 0.74%, with inoculation – 4.66 ± 1.39%. The level of expression of the gfp gene was higher when using inoculation with agrobacteria, and the gus gene was higher during vacuum infiltration. Using PCR analysis, the integration of the gfp and gus genes into the callus of spelt genome was confirmed. The length of the PCR product with primers for the gus gene was 240 bp, and 717 bp for the gfp gene. Conclusions. The use of vacuum infiltration and inoculation methods for spelt genetic transformation gave different results. The frequency of genetic transformation ranged from 3.66 to 4.66%. Agrobacterium-mediated genetic transformation of amphidiploid spelt wheat allows us to study the expression of gus and gfp reporter genes using callus explants derived from mature embryos

Мета. Введення в культуру in vitro та одержання калюсів із зрілих зародків 3 зразків пшениці спельти та порівняння ефективності їхнього калюсогенезу із 2 зразками пшениці м’якої. Методи. Для проведення цього дослідження було обрано 5 зразків гексаплоїдної пшениці: 3 – спельти та 2 – пшениці м’якої. Стерилізацію зерна проводили 96% етиловим спиртом та 5% розчином гіпохлориту натрію. Для уведення в культуру in vitro експлантами брали зрілі зародки. Для калюсогенезу використали три типи живильних середовищ Мурасіге і Скуга (МS) з різним компонентним складом. Експланти культивували в темряві 21 добу. Результати. Підібрано оптимальні умови для індукції культури тканин Triticum spelta L. та T. aestivum L. із зрілих зародків. Отримані з різних зразків калюси, які вирощували на трьох типах модифікованого живильного середовища МS, не відрізнялись між собою морфологічно. У сортів спельти ‘Європа’ і пшениці м’якої ‘Бунчук’ та ‘Елегія Миронівська’ незалежно від складу середовища спостерігали високу ефективність калюсоутворення, у той час як на експлантах спельти сорту ‘Зоря України’ відбувалось повільне формування калюсу. Висновки. З експлантів зрілих зародків отримано культуру тканин 3 зразків спельти та 2 зразків пшениці м’якої. Встановлено, що найефективнішими для калюсоутворення з експлантів зрілих зародків пшениці м’якої та спельти було живильне середовище MS з 3% сахарози, доповнене 2 мг/л 2,4-Д, 10 мл/л арґентумом нітрату. Ефективність калюсогенезу на 21 добу культивування, залежно від зразка, варіювала в межах 80,2–100,0%. Досліджувані зразки відрізнялись між собою за здатністю формувати калюси на живильних середовищах із різним компонентним складом.