Molekulare Grundlagen der Entwicklung des Schwertes, eines sexuell selektierten Merkmales im Genus Xiphophorus | The molecular basis of development of the sword, asexual selected trait in the genus Xiphophorus

Das Schwert, eine farbige Verlängerung der Kaudalflosse männlicher Schwertträger der Gattung Xiphophorus, war eines von Charles Darwins Beispielen für seine Idee der sexuellen Selektion. Experimente mit X. helleri zeigten zum einen, dass die Länge des Schwertes eine wichtige Rolle bei der Partnerwahl spielt und zum anderen, dass Weibchen eine Präferenz für ein spezielles Farbmuster des Schwertes mit verschiedenfarbigen Streifen haben. Neben seiner Funktion als sexuell selektiertes Merkmal, besitzt das Schwert eine interessante Evolutionsgeschichte. Nur die Männchen der Schwerträgerarten entwickeln ein Schwert, während die Männchen von Platyarten, die eine zweite Gruppe innerhalb der Gattung Xiphophorus darstellen, kein Schwert besitzen. In einem Szenario stammen beide Gruppen von einem gemeinsamen Vorfahren ab, dessen Männchen ein Schwert ausbildeten. Das Schwert ging daher folglich sekundär im Laufe der Evolution in Platys verloren. Es bleibt schwer zu fassen, welche Ereignisse auf der molekularen Ebene zum Verlust des Schwertes führten, da das genetische Netzwerk, das die Schwertentwicklung kontrolliert sehr schlecht untersucht ist Kreuzungsexperimente mit unterschiedlichen Arten zeigten, dass mehrere genetische Loci die Schwertentwicklung kontrollieren. Zusätzlich konnte Testosteron als ausreichender Faktor für die Induktion der Schwertentwicklung in Fischen vor der Geschlechtsreife identifiziert werden. Dies deutet darauf hin, dass die Schwertentwicklung durch Androgene kontrolliert wird. Eine kürzlich verfasste Arbeit zeigte zudem, dass der Homeobox-Transkriptionsfaktor msxC in wachsenden Schwertstrahlen hochreguliert wird und somit vermutlich in der Schwertentwicklung eine Rolle spielt. msxC wird zudem in Flossenstrahlen des wachsenden Gonopodiums hochreguliert, eine Analflosse die wie die Kaudalflosse im Männchen unter dem Einfluss von Testosteron modifiziert wird. Das Gonopodium entstand im Laufe der Evolution vor dem Schwert und es wird angenommen, dass ein Teil des genetischen Netzwerks, das die onopodiumentwicklung kontrolliert, für die Entwicklung des Schwertes adaptiert wurde.In Kapitel I konzentrierten wir uns auf den Fgf Signalweg, der die Expression von msxC während der Regeneration der Kaudalflosse reguliert. Sowohl dieSchwertentwicklung als auch die Flossenregeneration zeichnen sich durch ein schnelles Wachstum der Flossenstrahlen aus und es wird angenommen, dass dieses Wachstum von einem konservierten genetischen Netzwerk kontrolliert wird. Wir konnten zeigen, dass fgfr1 in wachsenden Schwertern und Gonopodien hochreguliert wird, was ein erstes Anzeichen dafür ist, dass fgfr1 eine Rolle in diesen Prozessen spielt. fgfr1 und msxC wurden in einem vergleichbaren zeitlichen und räumlichen Muster exprimiertund interagieren daher wahrscheinlich miteinander. Hingegen wurden beide Gene im ventralen Teil der Kaudalflossen von Testosteron-behandelten Platys erst nach extensiver Behandlung mit dem Hormon hochreguliert. Dies spricht dafür, dass es im Laufe der Evolution zu einer Störung der Regulation des fgfr1/msxC-Netzwerks durch Testosteron kam, die in Platys zum Verlust der Fähigkeit führte, ein Schwert zu entwickeln. Zum Abschluss zeigten wir, in X. maculatus brushtail Mutanten, dass die Stärke der Aktivierung von fgfr1 und msxC in den Flossenstrahlen positiv mit deren Wachstumsrate korreliert. Die medianen Flossenstrahlen dieser Mutante zeichnen sich durch starkes Wachstum aus.Nur ein kleiner Teil der Gene die die Schwertentwicklung kontrollieren, können mit einem sogenannten Kandidatengenverfahren (siehe Kapitel I) identifiziert werden, da nur Gene ausgewählt werden, wenn Informationen über diese Gene und/oder ihre Funktion vorhanden sind. Um diese Limitierung zu umgehen verwendeten wir in Kapitel 2 die "suppression subtractive hybridisation" Technik (SSH), da es diese Methode ermöglicht Gene zu identifizieren, die in sich entwickelnden Schwertern und Gonopodien im Vergleich zu Flossen von Jungtieren hochreguliert sind. Die Methode erfordert dabei keine vorherige Kenntnis über bestimmte Gene oder deren Funktion. In dieser Studie wurden von uns 128 Sequenzen mit einer hohen Ähnlichkeit zu Genen in Datenbanken isoliert. Wir zeigten, dass vier dieser Gene mit Ähnlichkeit zu rack1, dusp1, klf2 and tmsb a-like spezifisch in sich entwickelnden Schwertern und Gonopodien hochreguliert wurden. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass diese Gene auch während der Flossenregeneration hochreguliert wurden. Somit sind diese Gene interessante Kandidaten für weitere Analysen bezüglich ihrer Rolle in der Schwertentwicklung und Flossenregeneration.Die Analflosse von Männchen aller Xiphophorus-Arten wird in ein Begattungsorgan, das sogenannte Gonopodium umgewandelt. Das Gonopodium wird von drei Flossenstrahlen, dem 3-4-5 Komplex gebildet. Diese drei Flossenstrahlen sind stark verlängert und weisen unterschiedliche terminale Strukturen, wie Hacken, Klauen, Dornen und Serraes auf. Daher weist das fertig entwickelte Gonopodium eine starke proximal-distale Polarität auf, die durch die terminalen Strukturen und kürzere terminale Segmente bedingt wird. Die Entwicklung des Gonopodiums erfolgt in zwei Phasen. Während der ersten Phase regt ein geringer Testosteronspiegel das Wachstum des 3-4-5 Komplexes an, während ein hoher Testosteronspiegel in Phase zwei die Bildung von terminalen Strukturen auslöst. Der Shh-, androgene und vermutlich auch der Fgf-Signalweg spielen bei der Gonopodiumentwicklung eine Rolle.In Kapitel 3 testeten wir aus zwei Gründen die Rolle des Retinsäure-Signalwegs (RA) während der Gonopodiumentwicklung. Zum einen ist der RA-Signalweg essentiell für die Entwicklung von paarigen Extremitäten in Wirbeltieren, zum anderen vermittelt er Positionsinformationen entlang der proximal-distalen Achse in wachsenden und regenerierenden Beinen. Daher könnte der RA-Signalweg eine eher generelle Rolle in der Entwicklung des Gonopodiums spielen oder speziell in die Etablierung der proximaldistalen Polarität involviert sein. Retinsäure (RA) ist ein kleines, lipophiles, diffundierendes Molekül, das von Retinaldehyddehydrogenasen (Aldh1as) synthetisiert wird und über zwei Typen von Retinsäurerezeptoren (RARs and RXRs) seine Zielgene aktiviert. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass aldh1a2, ein RA-Syntheseenzym, und zwei RA Rezeptoren (rarg-a and rarg-b) in sich entwickelnden Gonopodien hochreguliert werden. Eine Hemmung der RA Synthese mit DEAB erhöhte die Länge von neu gebildeten Segmenten, während eine überstarke Aktivierung des RA-Signalwegs mit exogener Retinsäure zu einer Verkürzung der Segmente führte. Sowohl die Expressionsdaten als auch die funktionellen Daten weisen auf eine Funktion von RA während der Gonopodiumentwicklung und speziell bei der Segmentierung hin. Abschließend zeigten wir, dass der androgene Rezeptor b (arb), ein möglicher Regulator des RA-Signalwegs, mit aldh1a2 im distalen Mesenchym von wachsenden Gonopodien exprimier twird. In wachsenden Schwertern fehlt diese Expressionsdomäne beider Gene, während beide Rezeptoren in Schwertern und Gonopodien ähnlich reguliert werden. Dies deutet darauf hin, dass beide Gene miteinander interagieren könnten.

The sword, a colourful extension of the ventral caudal fin of male swordtails of the genus Xiphophorus was one of Darwin's chosen examples for his idea of sexual selection. Experiments in X. helleri have shown that (1) the total length of the sword is an important criterion during mate choice and (2) the females have a preference for a specific pattern of differently coloured stripes. Besides its role in the process of sexual selection the sword has an interesting evolutionary history. Only males of swordtail species develop a sword, whereas males of platyfish, another group within the genus Xiphophorus, are swordless. One scenario suggests a sworded common ancestor of all Xiphophorus species and a secondary loss of the sword in platyfish during evolution. It remains elusive which molecular events preceded the loss of the sword in platyfish, since the genetic network that controls sword development is poorly understood. Data from interspecies crosses suggests that multiple loci control sword development. In addition, testosterone was identified as sufficient factor to induce sword development in immature fish, which indicates that sword development is controlled by androgen signalling. Recent work also identified the homeobox transcription factor msxC as another potential candidate, since it was shown to be up-regulated in growing sword rays. Up-regulation of msxC has also been found in the developing gonopodium, the modified male anal fin that is also induced by exogenous testosterone. The gonopodium is evolutionary older than the sword and it was assumed that the genetic network controlling gonopodium development was partly co-opted for the sword.In chapter I we focussed on Fgf signalling that has been shown to regulate msxC expression during caudal fin regeneration. Both sword development and fin regeneration are characterized by elevated outgrowth of fin rays, which is likely controlled by a conserved genetic network. We showed that fgfr1 is specifically up-regulated in developing swords, which presents first evidence that fgfr1 is involved in sword development. A similar pattern was also observed in the developing gonopodium. fgfr1 is spatial-temporally co-expressed with msxC both in the sword and the gonopodium, which might indicate a putative interaction between both genes. Interestingly, in the ventral caudal fin rays of testosterone treated platyfish, fgfr1 and msxC are only up-regulated after prolonged hormone treatment. This points towards a disruption between the fgfr1/msxC network and its regulation by testosterone as a likely developmental cause for sword-loss in platyfish. Finally, we demonstrated that fgfr1 and msxC activation is correlated with fin ray growth rates by employing the X. maculatus brushtail mutant that exhibits excessive growth of the median caudal fin rays.Only a subset of the genes involved in sword development can be targeted by candidate gene approaches (e.g. as performed in chapter I), because prior knowledge about gene function is needed to select appropriate candidates. In chapter II we employed the suppression subtractive hybridisation (SSH) technique to bypass this limitation, because this method can be applied to isolate genes that are differentially expressed in swords and gonopodia compared to juvenile fins without ab initio knowledge of gene identity or function. In this study we identified 128 different sequences with significant similarity to known genes. We showed that four of these sequences with similarity to rack1, dusp1, klf2 and tmsb a-like are specifically up-regulated in induced swords and/or gonopodia. In parallel, we also showed that these genes are strongly expressed during fin regeneration. Therefore these four genes are interesting candidates to further analyse their role in both sword development and fin regeneration.The anal fin of male Xiphophorus fishes is modified into an intromittant organ, the gonopodium. The gonopodium is formed during sexual maturation by a subset of three anal fin rays, the 3-4-5 complex. These three rays are modified in terms of ray length, segment thickness and different distal structures like blades, claws, spines, hooks and serraes. Therefore, the mature gonopodium exhibits a strong proximo-distal polarity due to the smaller terminal segments and terminal structures. Gonopodium development is thought to proceed in two phases. During the first phase, low levels of testosterone promote ray outgrowth, whereas high levels of testosterone induce the formation of terminal structures during the second phase. Shh, androgen and probably Fgf signalling are involved in gonopodium development.In chapter 3 we tested the role of retinoic acid (RA) signalling during gonopodium development, for two reasons. RA signalling is essential for paired appendage development in vertebrates and it provides positional information along the proximodistal axis in developing and regenerating limbs. Therefore, RA signalling might either play a general role in gonopodium development or specific role in establishing the proximo-distal polarity within the gonopodium. RA, a small lipophilic, diffusible molecule is synthesised by retinaldehyde dehydrogenases (Aldh1as) and stimulates gene expression through binding to two types of receptors, retinoic acid receptors (RARs) and retinoic X receptors (RXRs). In this study we showed that aldh1a2, a RA synthesising enzyme, and two RA receptors, rarg-a and rarg-b, are expressed in developing gonopodia. Inhibiting RA synthesis with DEAB increases the length of newly formed terminal segments, whereas the segment length decreases when RA signalling is overactivated by exogenous all-trans RA. Both the expression and the functional data present first evidence that RA signalling is involved in gonopodium development. Finally, we showed that androgen receptors b (arb), a putative regulator up-stream of RA signalling is co-expressed with aldh1a2 in the distal mesenchyme of the gononopodial rays. Interestingly, developing swords lack the distal expression domain of both aldh1a2 and arb, whereas the two rars are similarly expressed in developing swords and gonopodia. This might point towards an interaction between these two genes.