Desenvolvimento e diagnóstico da resistência anti-helmíntica em populações de haemonchus contortus no estado do Ceará.

Resumo: Os nematoides gastrintestinais são um dos principais fatores limitantes na criação de pequenos ruminantes no mundo. Os benzimidazóis (BZ), as lactonas macrocíclicas (LM) e os imidazotiazóis são os anti-helmínticos mais utilizados para o controle desses parasitas. Contudo, o uso de fármacos leva inevitavelmente ao desenvolvimento de resistência anti-helmíntica (RAH). O diagnóstico de RAH é realizado principalmente por meio de métodos fenotípicos com baixa sensibilidade. Dessa forma, métodos moleculares, são necessários para melhorar a capacidade de detecção da RAH. Os objetivos desse trabalho foram avaliar o estado da RAH em nematoides gastrintestinais de ovinos no Ceará, investigar a relação entre a resistência a BZ e LM e padronizar técnica de diagnóstico de resistência molecular a levamisol (LEV) em H. contortus. Para tanto, o trabalho foi dividido em três experimentos. No experimento I foi realizado um levantamento da situação da resistência a BZ por meio do teste de eclosão de ovos (TEO) e da PCR em tempo real (qPCR) para identificar os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) F167Y, F200Y e E198A. No experimento II foi realizada a seleção para resistência do isolado de H. contortus Inbred-Susceptible Edinburgh (ISE) com doses crescentes de oxifendazol (OXF), ivermectina (IVM) e oxifendazol mais ivermectina (IVMOXF). O desenvolvimento da resistência foi avaliado por qPCR, TEO para BZ e teste de desenvolvimento larva (TDL) para ivermectina. No terceiro experimento foi realizado a qPCR para o diagnóstico de resistência a LEV, baseando-se na deleção de 63pb no gene Hco-acr-8b codificante para os receptores nicotínicos de acetilcolina. Foram testadas 26 populações de H. contortus: Kokstad (LEV resistente), ISE (LEV susceptível) e 24 populações obtidas de rebanhos no estado do Ceará. Foi realizado o TDL para LEV em cinco isolados de campo. No experimento I a concentração efetiva média para inibir 50% da eclosão de ovos (CE50) no TEO foi de 2,46 ?g/mL (± 0,58 ?g/mL) e a resistência a BZ foi detectada em todas as fazendas pesquisadas. As frequências médias de alelos resistentes nos códons F200Y, F167Y e E198A foram 34,16% (± 12,13%), 58,31% (± 18,89%) e 0,016 (±0,012), respectivamente. No experimento II todos os tratamentos levaram ao aumento da frequência de alelos resistentes para os SNP F200Y e F167Y (p <0,05). Os resultados in vitro mostraram aumento da resistência fenotípica a ambas as classes anti-helmínticas nos grupos IVM e IVMOXF, enquanto o grupo OXF desenvolveu apenas resistência para BZ. No experimento III foi observado apenas alelos resistentes no isolado Kokstad. No isolado ISE a frequência de alelos resistentes foi de 45,50%. Foi verificada uma correlação significativa entre as CE50 do TDL e a frequência de alelos resistentes. O alelo resistente no SNP F167Y em H. contortus prevalece no Estado do Ceará. As evidências mostram que, embora estes SNPs possam ter algum envolvimento com a resistência a LM, não são suficientes para promover o desenvolvimento da resistência a ivermectina sozinhos. A qPCR para o diagnóstico de resistência a LEV pode ser útil para monitorar níveis de resistência em populações de H. contortus. Abstract: Gastrointestinal nematodes are one of the main limiting factors in small ruminant production around the world. Benzimidazoles (BZ), macrocyclic lactones (ML) and imidazothiazoles are the most common anthelmintics used in control of theses parasites. However, the use of these drugs inevitably induces the development of anthelmintic resistance (AHR). The diagnosis of AHR is performed mostly with phenotypic methods, which present low sensitivity. In this manner, molecular methods are necessary to improve the detection of AHR. The objectives of this study were: (1) to evaluate AHR levels in gastrointestinal nematodes of sheep in Ceará; (2) to investigate the relation between BZ and ML resistances; and (3) to standardize a molecular technique to diagnose levamisole resistance (LEV) in H. contortus. In order to do so, this study was divided in three experiments. In experiment I, an initial assessment of resistance to BZ was performed with egg hatch test (EHT) and real time PCR (qPCR) to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) F167Y, F200Y and E198A. In experiment II, a selection for resistance in H. contortus isolate Inbred-Susceptible Edinburgh (ISE) was performed with crescent doses of oxfendazole (OXF), ivermectin (IVM), and oxfendazole with ivermectin (IVMOXF). The resistance development was evaluated with qPCR, EHT for BZ and larval development test (LDT) for ivermectin. In experiment III, qPCR was used to diagnose LEV resistance, based on the deletion of 63bp in Hco-acr-8b gene that codifies nicotinic acetylcholine receptors. A total of 26 populations of H. contortus were tested: Kokstad (LEV-resistant), ISE (LEV-susceptible) and 24 populations obtained from flocks in Ceará State. LDT was performed for LEV in five field isolates. In experiment I, the average half maximal effective concentration (EC50) in EHT was 2.46?g/mL (± 0.58 ?g/mL) and BZ resistance was detected in all farms included in the study. Average frequencies of resistance alleles in codons F200Y, F167Y and E198A were 34.16% (± 12.13%), 58.31% (± 18.89%) and 0,016 (±0,012), respectively. In experiment II, all treatments increased the frequency of resistance alleles for SNP F200Y and F167Y (p<0.05). The in vitro results demonstrated the increase in phenotypic resistance to both anthelmintic drugs in groups IVM and IVMOXF, while OXF group developed resistance only to BZ. In experiment III, resistance alleles were only identified in Kokstad isolate. The frequency of resistance alleles in ISE isolate was 45.50%. A significant correlation between EC50 of LDT and the frequency of resistance alleles was identified. Our results confirmed that the resistance to BZ is common. The resistance allele in SNP F167Y in H. contortus prevails in Ceará State. Provided evidences indicate that, although SNP may be involved in resistance to ML, this influence alone is not enough to promote the development of ivermectin resistance. The use of qPCR to diagnose LEV resistance may be a useful tool to monitor resistance levels in H. contortus populations.

Portugués. Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza. Orientação: Claudia Maria Leal Bevilaqua; Coorientação: Jomar Patrício Monteiro (CNPC).