Determinação do número de inserções de transgene em plantas transgênicas de tabaco por reação da cadeia da polimerase em tempo real.

Portugués. Em plantas transgênicas, o número de cópias do transgene pode influenciar o nível de expressão e a estabilidade genética do gene alvo, o que torna a estimativa do número de cópias do transgene extremamente importante na pesquisa com culturas geneticamente modificadas. O gene Axi1, envolvido na ação das auxinas, já foi utilizado anteriormente como controle endógeno na determinação de número de inserções de trangenes de tabaco, no entanto não foi confirmado se esse gene é cópia única. Portanto, o objetivo desse trabalho foi estabelecer uma metodologia com PCR em tempo real (qPCR) para determinar o número de cópias em plantas transgênicas de tabaco, utilizando o gene Axi1 como controle endógeno. Plantas de tabaco (Petit havana) foram transformadas via Agrobacterium tumefaciens e regeneradas com vetor vazio (pMCG1005), com o gene de arroz Phosphorus Starvation Tolerance 1 (OsPstol1) e seus homólogos em milho (ZmPstol3.06, ZmPstol8.02 e ZmPstol8.05_1) e sorgo (Sb07g002840, Sb03g031690 e Sb03g006765) sob o promotor da ubiquitina e com o gene de seleção Bar. Para confirmar o número de cópias do gene Axi1, um fragmento desse gene de tabaco foi clonado e utilizado na confeccção de uma curva padrão. O número de cópias do gene foi obtido plotando-se valores de Ct obtidos de amostras de DNA genômico de tabaco de concentração conhecida nessa curva. Essa abordagem demonstrou que o gene Axi1 encontra-se em cópia única no genoma do tabaco. Assim, onze eventos de tabaco transgênico T0 fora avaliados com o método 2-ΔCt para determinar o número relativo de cópias do gene Bar no genoma, utilizando Axi1 como gene de referência. Uma amostra com uma cópia (ZmPstol8.02 Ev.6) foi estabelecida pelo metódo 2-ΔCt e utilizada como referência de cópia única usando o método 2-ΔΔCt. Os resultados da determinação do número de cópias foram concordantes com as taxas de segregação em plantas T1 com o genótipo Bar de cada evento. Todos os três eventos cópia únicas tiveram segregação Mendeliana de 3:1 e esses resultados confirmam que Axi1 é um gene cópia única e pode ser usado como um controle endógeno para avaliar o número de cópias com o método 2-ΔΔCt em tabaco transgênico.