Molecular diagnosis of phytoplasma diseases of grapevine [Vitis vinifera L.]

Inglés. Phytoplasmas are wall-less bacteria causing yellows and witches' broom type diseases in different plant species. In grapevine, phytoplasmas belonging to different taxonomic groups have been associated to a number of similar symptoms, collectively referred to as grapevine yellows. In Europe, phytoplasmas belonging mainly to two taxonomic groups have been associated to grapevine yellows: 16SrV, Flavescence doree (FD), and 16SrXII, Bois noir (BN). Phytoplasmas are generally present in low concentration and randomly distributed in the phloem of the host plant and their detection is often difficult. Diagnosis of FD and BN is performed by PCR. Total DNA is extracted from leaf veins of symptomatic plants following different protocols and then amplified with universal phytoplasma-specific primer pairs. Phytoplasma titre in the plant host is often below the detection limit of the PCR technique. False negative results from symptomatic grapevines can be reduced following different protocols: nested PCR and serological or molecular detection of PCR products. Restriction length polymorphism of amplicons obtained with universal primers is needed to distinguish between FD and BN

Italiano. I fitoplasmi, eubatteri privi di parete cellulare, parassiti obbligati di numerose specie vegetali, causano nella vite malattie a sintomatologia simile, definite giallumi. In Europa e su tutto il territorio nazionale sono stati segnalati giallumi della vite associati a fitoplasmi appartenenti principalmente a due gruppi tassonomici: 16SrV, Flavescenza dorata (FD), e 16SrXII, Legno nero (LN). La diagnosi delle fitoplasmosi della vite e' problematica a causa dell'erraticita' e del basso titolo con cui i fitoplasmi sono distribuiti nel floema dell'ospite vegetale, al di fuori del quale non possono sopravvivere. Le moderne tecniche di biologia molecolare consentono, oggi, di superare questi ostacoli, fornendo diversi protocolli per la diagnosi di FD e LN. La prima fase consiste nell'estrazione totale di DNA a partire dalle nervature principali delle foglie di vite, seguita da una reazione di amplificazione del DNA dei fitoplasmi, mediante la tecnica della PCR (PCR diretta). La scelta di opportuni iniziatori della reazione (primer), universali o gruppo-specifici per il genoma dei fitoplasmi, consente di effettuare reazioni a diverso grado di specificita'. La concentrazione dei fitoplasmi nella vite e' spesso inferiore al limite di rilevabilita' anche di una tecnica sensibile come la PCR. Per minimizzare il rischio di campioni falsi negativi, si puo' ricorrere a differenti soluzioni: un'ulteriore reazione di PCR (nested); reazioni di ibridazione con sonde molecolari specifiche (ELISA o dot blot) o, infine, digestioni enzimatiche degli ampliconi (RFLP)