Neonatal colisepticemia in broiler chickens : -Avian pathogenic Escherichia coli and risk factors for high first week mortality

Broiler chicken meat is regarded lean and more sustainable than meat from other terrestrial production animals. Because of this, the industry is continuing to grow globally. To maintain animal welfare, production sustainability and prevent antibiotic resistance in a growing industry, it is crucial to keep disease levels at a low. Colibacillosis, caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC), is one of the most frequently reported bacterial diseases in broiler chicken, and it comprises several local and systemic diseases, such as: salpingitis, cellulitis, colisepticemia and neonatal colisepticemia. Neonatal colisepticemia (NC) typically affects broiler chicken flocks within the first week post hatching, resulting in high mortality and morbidity. The mortality in a flock increases from one to five days post hatching, resulting in first week mortality (FWM) > 1.5 % and with some reports reaching 20 %. During 2014 – 2016, an increasing number of NC cases were reported in the Nordic countries. APEC (ST117, O78:H4) was later identified as the causative agent, but several other APECs were also identified. The reports revealed a lack of knowledge on the epidemiology of APEC within the Nordic broiler chicken industry. In addition, there was little knowledge of risk factors for high FWM due to NC. The main aim of the PhD project was to generate in-depth knowledge on the diversity of APECs causing NC in Norwegian broiler chicken flocks and their genetic traits. Further, the aim was to identify the risk factors for high FWM due to NC. This PhD project used whole genome sequencing (WGS) and bioinformatic analysis to map and type confirmed APEC isolates that were collected from Norwegian broiler chicken flocks with high FWM in 2018 to 2021. Multi locus sequence- and serotyping identified high sequence similarity between isolates from the same bird and identified that one to five APECs may be identified within affected flocks. Close to half of the distinct STs were only identified once. Core gene phylogenetic analysis of a total of 219 APEC isolates showed that two distinct sequence types (ST) sharing the same serotype profile may be genetically distant. The analysis, together with flock related metadata, also identified two distinct, single-strain outbreaks of APEC across farms: ST23, O78:H4 and ST429, O2/O50:H1. All 219 APEC isolates from this study were screened for virulence-associated genes (VAGs) using an updated and extended database covering E. coli and APEC related VAGs. The screening showed what VAGs the outbreak-isolates carry and compared these to the other APEC isolates included in the analysis. Finally, a matched case-control study, including the same flocks as the molecular study, identified high FWM in the previous flock (OR = 3.33) and flock size (OR = 1.7) as risk factors for high FWM due to NC. Altogether, this PhD study presents novel information on the molecular epidemiology of APEC in the Norwegian broiler chicken industry. The analyses illustrated the need to sample multiple birds to identify the disease-causing APEC within a flock and the importance of combining two methods (e.g. MLST and serotyping) for the precise typing of APEC. This work identified two highly virulent strains of APEC, which were alone capable of causing disease in more than one flock within a few months. The high resolution, core genome phylogenetic analysis of the outbreak isolates was shown to be useful for APEC outbreak investigations and indicated that the SNP-distances might be somewhat different from what is reported for outbreaks of zoonotic agents. The screening for VAGs also confirmed the carriage of hlyF and ompT, two genes known to be important for virulence, in APEC. Furthermore, the risk factor study identified the need for more research on the survival of APEC in the poultry house between flocks. To avoid rapid spread of disease within the flock, producers of large flocks should increase the management capacity to remove and cull dead and morbid birds when an outbreak of NC is suspected.

Kyllingkjøtt er et magert og bærekraftig produkt sammenliknet med annet kjøtt fra landbruket. Dette fører til økt etterspørsel og produksjon. For å vedlikeholde dyrevelferden, den bærekraftige produksjonen og holde antibiotika forbruket på et lavt nivå i en voksende industri, er det viktig å holde sykdommer på et lavt nivå. Colibacillose er en fellesbetegnelse på lokale eller systemiske infeksjoner, forårsaket av Aviær patogene E. coli (APEC), og inkluderer, blant annet: egglederbetennelse, navle- og plommesekk betennelse, cellullitt, hjarre’s sykdom, colispetikemi og neonatal coliseptikemi. Det er ansett som en av de vanligste bakterielle sykdommene hos fjørfe på verdensbasis. Neonatal coliseptikemi (NC) forårsaker høy førsteuke-dødelighet blant slaktekylling. I en flokk med NC øker dødeligheten typisk fra dag én til fem etter klekking: førsteuke-dødeligheten i flokken overstiger ofte 1,5 %, og internasjonalt har det vært rapportert flokker med førsteuke-dødelighet opp mot 20%. Mellom 2014 og 2016 ble det observert en økning av NC blant slaktekylling i de nordiske landene. Analyser av prøver viste at sekvenstype (ST) 117, serotype O78:H4 var hovedårsaken til de overnevnte problemene, men analysene identifiserte også flere ulike typer APEC. Det ble klart at det manglet kunnskap om hvilke APEC som sirkulerer i den nordiske slaktekylling populasjonen. Det manglet også kunnskap om hvilke risikofaktorer i kyllingens miljø som kunne potensielt bidra til den økte dødeligheten i flokken. Ved hjelp av moderne sekvenserings teknologi og bioinformatiske analyser var målet med dette PhD-prosjektet å bidra med økt kunnskap om APEC som forårsaker NC blant norsk slaktekylling. Videre var det et ønske om å tilegne seg kunnskap om hvilke risikofaktorer som kunne bidra til den høye førsteuke-dødeligheten i flokker med NC. I prosjektet har vi helgenomsekvensert 219 APEC isolater fra til sammen 49 slaktekylling og oppalsflokker med NC og høy førsteuke-dødelighet. Isolatene har blitt typet ved hjelp av multi locus sequence typing (MLST) og serotyping. Analysene viste høy ST-likhet innad i en fugl, mens innad i en flokk ble det identifisert opp til fem ulike STer. Halvparten av STene presentert i studiet ble kun identifisert i ett enkelt isolat. Fylogenetiske analyser av alle isolatene viste hvordan to ulike STer kan ha samme serotype-profil, men samtidig være svært genetisk ulike. Sammen med metadata fra flokkene, ble det videre identifisert to større utbrudd forårsaket av to ulike APEC-varianter: ST23, O78:H4 og ST429, O2/O50:H1. Fylogenetiske kjernegenom analyser av utbrudds-isolatene viste SNP (single nucleotide polymorphism)-distansene mellom isolater prøvetatt innad i en flokk og mellom flokker diagnosert med NC. Ved hjelp av en utvidet gen-database ble alle de 219 APEC isolatene undersøkt for virulens-assosierte gener (VAGer). Resultatene sammenliknet forekomsten av de ulike VAGene i utbruddsisolatene, opp mot de øvrige isolatene inkludert i analysen. Tilslutt, ved hjelp av en «matched case-control» studie, ble det indentifisert to risikofaktorer for høy første-uke dødelighet grunnet NC: høy førsteuke-dødelighet i forrige flokk (OR = 3,33) og flokkstørrelse (OR = 1,7). Resultatene fra dette doktorgradsstudiet har gitt viktig og utdypende informasjon om epidemiologien av APEC innad i norsk slaktekylling produksjon. Det ble vist at det er nødvendig å ta prøver fra mer enn en kylling i en flokk for å identifisere hvilke(n) type(r) APEC som var årsaken til NC i flokken. Analysene viste også viktigheten av at to ulike typings-metoder blir brukt (f.eks MLST og serotyping) for å presist kunne type APEC. Det ble videre identifisert to høy-virulente typer APEC som enkeltvis forårsaket utbrudd av NC på tvers av gårder i Norge. De fylogenetiske analysene ga et viktig innblikk i hva vi kan forvente av likheter mellom APEC isolater fra slike utbrudd. Analysene som undersøkte for VAGer viste hvilke VAGer vi kan forvente blant APEC, og i særs hvilke VAGer de høy-virulente utbrudds-isolatene bar. Analysene bekreftet at tilnærmet alle APEC isolatene var bærere av hlyF og ompT genene, også kjent som viktige for virulens. Risikofaktor-studiet viste at det er behov for videre undersøkelser rundt hvordan APEC overlever i fjørfehuset mellom flokker. Resultatene indikerte også at produsenter med store flokker bør vurdere å be om hjelp til å fjerne døde og morbide fugler ved mistanke om NC, for å unngå rask spredning av sykdommen i flokken.