Expresión de antígenos derivados del virus de la fiebre aftosa en diferentes sistemas eucarióticos

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2000

La fiebre aftosa es una enfermedad de gran importancia económica que afecta principalmente al ganado bovino. Esta enfermedad está causada por un picornavirus, el virus de la fiebre aftosa (VFA). El control de la enfermedad se lleva a cabo mediante eliminación de los animales infectados y vacunación con vacunas basadas en virus inactivado. Existen varias desventajas relacionadas con la producción y el uso de tales vacunas, entre las que están la reintroducción de la enfermedad debida a la manipulación de grandes masas virales o a la incorrecta inactivación del virus, por lo que el desarrollo de vacunas recombinantes más seguras aparece como una alternativa de gran interés. En el presente trabajo se estudió la posibilidad de expresar sitios antigénicos simples y complejos derivados del VFA en diferentes sistemas de expresión. La poliproteína P1, precursora de las proteínas estructurales del virus, pudo expresarse con éxito en un sistema bacteriano y en el sistema “baculovirus-células de insecto”. Sin embargo, las diferentes versiones de esta proteína no fueron capaces de montar una respuesta efectiva contra el VFA,probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. Por otro lado, el sitio antigénico inmunodominante (sitio A) presente en el loop V-H de la proteína VP1 se expresó con éxito como fusión a la proteína transportadora core del virus de la hepatitis B (VHB) en células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes. Esta proteína quimérica no adoptó Ia estructura multimérica esperada, la que se consiguió mediante coinfecciones con un baculovirus que expresaba la proteína core. De todos modos, las partículas obtenidas resultaron pobres inmunógenos cuando se inyectaron en animales experimentales, hecho debido probablemente a la baja densidad de epitopes derivados del VFA en las preparaciones vacunales. Finalmente, tanto el sitio A como la poliproteína P1 pudieron expresarse como fusión a la glicoproteína gp64 del baculovirus AcNPV. Estas proteínas quiméricas se localizaron tanto en la membrana de células infectadas como en la superficie de los baculovirus recombinantes. Esta localización asegura una conformación particulada sobre un soporte fosfolipídico (características relacionadas con el aumento de inmunogenicidad de sitios antigénicos) y facilita la purificación de los inmunógenos. Cuando se vacunaron ratones con estas construcciones, los baculovirus llevando el sitio A y las células infectadas con éstos despertaron una respuesta inmune humoral neutralizante contra el VFA, aún en ausencia de adyuvantes. De nuevo, las construcciones llevando P1 fallaron para montar una respuesta inmune humoral neutralizante, probablemente debido a un incorrecto plegamiento espacial. La posibilidad de producir baculovirus recombinantes y células infectadas que lleven en sus superficies sitios antigénicos derivados de patógenos de interés veterinario mediante infección de larvas puede convertirse en una manera sencilla y económica de producción de vacunas de nueva generación.

Foot-and-mouth disease (FMD)is an economically very important disease of cattle and other farm animals. It is caused by a picornavirus, foot-and-mouth disease virus (FMDV).The control is achieved by slaughter of infected and contact animals and systematic vaccination with inactivated virus-based vaccines. Although these vaccines have been effective in controlling the disease, there are a number of concerns about their production and use, such as the risk of reintroduction of the disease by handling of infectious virus or incomplete inactivation of the antigen. These disadvantages have led to efforts to develop safer recombinant vaccines using genetic engineering. In the present work, the possibility of expressing simple and complex antigenic sites from FMDV in different expression systems has been assessed. P1 polyprotein, the precursor of the four capsid proteins, has been successfully expressed in bacteria and insect cells. However, different versions of this protein failed to elicit a protective immune response to FMDV,probably due to an incorrect folding of the protein. On the other hand, immunodominant site A, located at the G-H loop of VP1, was successfully expressed as a fusion protein with the core protein of hepatitis B virus (HBV)in the baculovirus system. However, this chimaeric protein failed to adopt the expected multimerio conformation. Interestingly, multimerio particles were obtained by coinfections with a recombinant baculovirus expressing the wild type core protein, but the hybrid core particles obtained resulted poor immunogens in mice, probably due to low FMDV epitope density present in the particles. Finally, both site A and P1 polyprotein could be expressed as fusion proteins with baculoviral glycoprotein gp64 of baculovirus AcNPV. These chimaeric proteins localized in the membrane of the infected insect cells as well as onto the surface of recombinant baculoviruses. This localization ensures a particulate conformation on a phospholipidic layer (both characteristics related to an increase of immunogenicity of simple antigenic sites) and facilitates the purification of immunogens. Experimental mice inoculated with gp-site A fusion protein expressed both in the surface of recombinant baculoviruses or in the membrane of infected cells elicited a specific humoral immune response with neutralizing activity against FMDV,even in the absence of adjuvants. Similar constructions bearing gp-P1 fusions failed to elicit a humoral immune response with neutralizing activity when inoculated in mice. The expression of antigens from veterinary pathogens with economic importance on the surface of baculovirus and infected cells by infecting insect larvae could be an alternative, safe method to reduce the costs of this kind of vaccines.

Instituto de Biotecnología

Fil: Taboga, Oscar Alberto. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina