Rapid and cloning‑free screening of edited alfalfa via next‑generation sequencing

The identification of full knockout plants is frequently the rate-limiting step of the research and commercial projects searching the complete loss of the function of target genes via the CRISPR/Cas9 system. This problem is particularly acute in polyploid crops such as alfalfa, where the common screening needs cloning and Sanger sequencing. Here, we produced and analyzed fifteen edited events containing different doses of edited alleles for three unrelated target genes. This analysis showed that next-generation sequencing (NGS) technology largely increases the efficiency of the determination of the exact genotype of an individual plant and that this increased performance is related to the high output of sequences produced by this alternative genotyping approach rather than to a higher balanced amplification of the alleles. Finally, we discuss the possible applications of NGS technology in other polyploid crops with complex genetics.

Instituto de Biotecnología

Fil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Stritzler, Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Pascuan, Cecilia Gabriela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Pascuan, Cecilia Gabriela. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Pascuan, Cecilia Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Bottero, Ana Emilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Bottero, Ana Emilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Bottero, Ana Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Gomez, Maria Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Gomez, Maria Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Gomez, Maria Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Frare, Romina Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Frare, Romina Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Frare, Romina Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Puebla, Andrea Fabiana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Puebla, Andrea Fabiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Tajima, Hiromi. University of California. Department of Plant Sciences; Estados Unidos

Fil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Ayub, Nicolás Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Fil: Blumwald, Eduardo. University of California. Department of Plant Sciences; Estados Unidos

Fil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Fil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética Ewald A. Favret; Argentina

Fil: Soto, Gabriela Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina