Functional study of key fish interferon-stimulated genes using an in vitro knock-out approach in fish cell lines : from comparative immunology to interest for vaccine production | Étude fonctionnelle de gènes stimulés par l'interféron par une approche in vitro d'invalidation génique en lignées cellulaires de poisson : de l'immunologie comparée à l'intérêt pour la production de vaccins

Inglés. In jawed vertebrates, innate antiviral defenses are primarily based on type I interferons (IFNs). These master cytokines are secreted following virus recognition and induce the expression of hundreds of IFN-stimulated genes (ISGs). ISGs encode proteins with diverse functions, including enhancers of the type I IFN pathway and antiviral effectors, which all work towards establishing an antiviral state refractory to viral infection. Overall, the type I IFN system is well-conserved between mammals and fish but the ISGs repertoire is more diverse in fish, largely due to their complex evolutionary history and physiological specificities. Consequently, most mammalian ISGs have one or more orthologs in fish. However, it is still unclear whether fish ISGs are true functional homologs and their mechanisms of action remain to be explored in detail.In this context, my thesis aimed to functionally characterize two key fish ISGs, namely dsRNA-dependent protein kinase (pkr) and virus inhibitory protein endoplasmic reticulum-associated, interferon-inducible (viperin), by using an in vitro knock-out approach. In mammals, both proteins are primarily regarded as antiviral effectors: PKR is involved in host translation inhibition and apoptosis, while Viperin operates by generating antiviral ribonucleotides and modulating metabolic pathways exploited during viral life cycles. However, the extent to which these functions are conserved in fish remains largely unknown. The objectives of my thesis were articulated along three axes: (1) to develop and validate pkr-/- and viperin-/- fish cell lines using the CRISPR/Cas9 technology; (2) to functionally characterize these cell lines, in order to identify the mechanisms of action of fish PKR and Viperin and their role in regulating the type I IFN response through feedback loops; (3) to assess their permissivity to viral infections and their ability to produce viral particles at higher yields than their wild-type counterparts.Using complementary overexpression and knockout approaches, I first studied the molecular mechanisms of action of PKR in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) CHSE-EC cells. Our findings show that salmonid PKR has conserved molecular functions, including apoptosis activation and inhibition of host protein synthesis. However, endogenous PKR did not play a major antiviral role during viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) infection. In fact, our results suggest that VHSV has evolved strategies to subvert PKR antiviral action, by limiting early induction of pkr expression, evading PKR-mediated translational arrest and taking advantage of PKR-mediated apoptosis at a late infection stage to favor viral spread.In parallel, we conducted a comparative RNA-seq analysis of the viperin-/- and wild-type fathead minnow (Pimephales promelas) EPC-EC cell lines with or without stimulation with recombinant type I IFN to have a global overview of the regulatory role of fish Viperin. Our data show that cyprinid Viperin is not involved in the regulation of the canonical type I IFN but negatively regulates specific inflammatory pathways. Our analysis further indicates that it plays a regulatory role in other metabolic processes, even in non-induced conditions, including extracellular matrix organization, cell adhesion and one carbon metabolism.During the development process of initial pkr-/- cell lines, two CHSE-EC cell lines were found to be persistently infected with infectious pancreatic necrosis virus (IPNV), presumably due to inadvertent contamination. I set out to characterize these persistently IPNV-infected cell lines over the course of 40 passages. A striking feature in both cell lines was the periodic oscillatory pattern of extracellular titers and intracellular viral RNA levels over passages. We further showed that the type I IFN response was not triggered during persistent infection, suggesting that persistent IPNV is able to evade the host innate immune response.

Francés. Chez les vertébrés à mâchoires, les défenses antivirales innées sont principalement basées sur les interférons (IFN) de type I. Ces cytokines sont sécrétées en cas d'infection virale et induisent l'expression de gènes stimulés par l'IFN (ISGs). Les ISGs codent des protéines aux fonctions diverses dont l'expression conduit à l'établissement d'un état réfractaire à l'infection. Le système IFN de type I est globalement bien conservé entre les mammifères et les poissons, mais le répertoire des ISGs est plus diversifié chez ces derniers, en raison de leur histoire évolutive complexe et de leurs spécificités physiologiques. Par conséquent, la plupart des ISGs de mammifères ont un ou plusieurs orthologues chez les poissons. Il reste, cependant, à déterminer si les ISGs de poisson ont les mêmes fonctions et mécanismes d'action que leurs homologues mammaliens.Dans ce contexte, ma thèse avait pour but de caractériser fonctionnellement deux ISGs de poisson, pkr et viperin, en utilisant une approche in vitro d'invalidation génique. Chez les mammifères, la PKR est principalement impliquée dans l'inhibition de la traduction et l'apoptose, tandis que la Viperin agit en générant des ribonucléotides antiviraux et en modulant certaines voies métaboliques exploitées par les virus. Chez les poissons, ces fonctions restent à explorer en détail. Les objectifs de ma thèse s'articulaient autour de trois axes : (1) développer des lignées cellulaires de poisson pkr-/- et viperin-/- en utilisant la technologie CRISPR/Cas9 ; (2) caractériser fonctionnellement ces lignées, afin d'identifier les mécanismes d'action de la PKR et de la Viperin de poisson et leur rôle dans la régulation de la réponse IFN; (3) évaluer leur permissivité aux infections virales et leur capacité à produire des virus à plus hauts rendements que ceux obtenus en cellules sauvages.En utilisant des approches complémentaires de surexpression et d'invalidation génique, j'ai tout d'abord étudié les mécanismes d'action de la PKR en cellules de saumon Chinook (Oncorhynchus tshawytscha). Nos résultats montrent que la PKR de salmonidés a des fonctions moléculaires conservées : elle est impliquée dans l'activation de l'apoptose et l'inhibition de la synthèse des protéines de l'hôte. Cependant, la PKR n'a pas de rôle majeur lors de l'infection par le virus de la septicémie hémorragique virale (VSHV) : nos résultats suggèrent que le VSHV a développé des stratégies pour échapper aux effets antiviraux de la PKR, en limitant l'expression précoce de pkr, en évitant l'inhibition de la traduction et en tirant partie de l'apoptose médiée par la PKR à un stade d'infection tardif pour favoriser la propagation du virus.En parallèle, nous avons mené une analyse transcriptomique comparative des lignées cellulaires du poisson tête-de-boule (Pimephales promelas), sauvages ou viperin-/-, stimulées ou non par l'IFN de type I, dans le but d'avoir une vue d'ensemble du rôle régulateur de la Viperin chez les cyprinidés. Nos données montrent que la Viperin n'est pas impliquée dans la régulation de la réponse IFN de type I mais qu'elle régule négativement certaines voies inflammatoires. Notre analyse indique aussi que la Viperin a une fonction régulatrice dans d'autres processus métaboliques tels que l'organisation de la matrice extracellulaire, l'adhésion cellulaire et le métabolisme un-carbone.Au cours du processus de développement de lignées cellulaires pkr-/- initiales, deux lignées se sont révélées être infectées de façon persistante par le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (IPNV). J'ai entrepris de caractériser ces lignées cellulaires infectées au cours de 40 passages. Nous avons ainsi observé la présence d'oscillations périodiques des titres viraux extracellulaires et des niveaux intracellulaires d'ARN viral au cours des passages. De plus, la réponse IFN de type I n'était pas déclenchée par l'infection, ce qui suggère que l'IPNV persistant est capable d'échapper à la réponse innée de l'hôte.