Evaluación de Péptidos Análogos a la Proteína Tir Como Moléculas de Reconocimiento en Biosensores Electroquímicos para la Detección de Escherichia Coli O157:H7 en Matrices Acuosas

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Los biosensores son sistemas basados en nanomateriales y biomoléculas que exhiben notables propiedades, tales como: simplicidad, portabilidad, eficiencia y facilidad de usar para la detección de patógenos como Escherichia coli. En este trabajo se informa por primera vez sobre el diseño de nuevos péptidos basados en la proteína TIR, un receptor de la proteína de membrana intimina característica de E. coli. Estos nuevos péptidos se utilizaron como elementos de reconocimiento para la detección de E. coli. Para este estudio, utilizando la herramienta LigPlot, se realizó un análisis de interacción entre intimina y TIR utilizando la estructura PDB: 2ZQK. Posteriormente, la secuencia asociada a la zona de interacción de TIR fue modelada con PEP-FOLD. Finalmente, a partir de los modelos obtenidos se realizó un estudio de Docking molecular y análisis de interacción, que permitieron definir dos moléculas de reconocimiento denominadas PEPTIR 1 y PEPTIR 2.0, las cuales fueron inmovilizadas en un transductor electroquímico basado en nanomateriales y se evaluó su capacidad de detección de E. coli mediante técnicas electroquímicas. El biosensor basado en PEPTIR 1.0 mostró la capacidad de detectar E. coli, exhibiendo un rango de trabajo lineal entre 0 a 500 UFC / mL y límites de detección y cuantificación de 2 y 6 UFC / mL, respectivamente. Además, el dispositivo mostró la capacidad de detectar de manera selectiva E. coli en presencia de otros microorganismos como P. aeruginosa y S. aereus. Por lo que se destacan la posibilidad de que este dispositivo pueda ser utilizado en la detección rápida, sensible y selectiva de E coli en matrices acuosas. Mientras que el biosensor basado en PEPTIR 2.0 mostró un gran potencial para ser evaluado en su capacidad para detectar con un mayor espectro, microorganismos gramnegativos en una matriz acuosa.

Biosensors are systems based on nanomaterials and biomolecules that exhibit remarkable properties, such as: simplicity, portability, efficiency and ease of use for the detection of pathogens such as Escherichia coli. This work reports for the first time on the design of new peptides based on the TIR protein, a receptor for the intimin membrane protein characteristic of E. coli. These new peptides are used as recognition elements for the detection of E. coli. For this study, using the LigPlot tool, an interaction analysis between intimin and TIR was performed using the PDB: 2ZQK structure. Subsequently, the sequence associated with the TIR interaction zone was modeled with PEP-FOLD. Finally, from the obtained models, a molecular docking study and interaction analysis were carried out, which allowed defining two recognition molecules called PEPTIR 1 and PEPTIR 2.0, which were immobilized in an electrochemical transducer based on nanomaterials and their capacity was evaluated. detection of E. coli by electrochemical techniques. The biosensor based on PEPTIR 1.0 showed the ability to detect E. coli, exhibiting a linear working range between 0 to 500 CFU / mL and detection and quantification limits of 2 and 6 CFU / mL, respectively. Furthermore, the device showed the ability to selectively detect E. coli in the presence of other microorganisms, such as P. aeruginosa and S. aereus. Therefore, the possibility that this device can be used in the rapid, sensitive and selective detection of E coli in aqueous matrices stands out. While the biosensor based on PEPTIR 2.0 showed great potential to be evaluated in its ability to detect with a wider spectrum, gram-negative microorganisms in an aqueous matrix.

Maestría

Magister en Biotecnología

1 ed.

Introducción .................................................................................................................................. 17 1. Marco de Referencia ................................................................................................................. 22 1.1 Marco de Antecedentes ................................................................................................... 22 1.2 Marco Legal ..................................................................................................................... 25 1.3 Marco Teórico ................................................................................................................. 29 1.3.1 E. coli O157:H7 y sus Proteínas de Adhesión: Intimina y TIR .................................... 29 1.3.2 Biosensores Electroquímicos ........................................................................................ 32 1.3.3 Nanopartículas de Oro (AuNPs) en el Diseño de Biosensores Electroquímicos ......... 32 1.3.4 Péptidos ........................................................................................................................ 35 1.3.5 Proteínas de Membrana Externa ................................................................................... 35 1.3.6 Bioinformática Estructural ........................................................................................... 36 2. Objetivos ................................................................................................................................... 37 2.1 Objetivo General .............................................................................................................. 37 2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................................... 37 3. Péptido Bioinspirado en la Proteína Tir como Molécula de Reconocimiento en Biosensores Electroquímicos Modificados con Aunps para la Detección de E. Coli O157: H7 en Matrices Acuosas ......................................................................................................................................... 38 3.1 Resumen .......................................................................................................................... 38 3.2 Metodología ..................................................................................................................... 39 3.2.1 Reactivos, Materiales e Instrumentos ........................................................................... 39 3.2.2 Diseño de Péptidos Análogos a la Proteína TIR de E. Coli O157:H7 Mediante Herramientas Bioinformáticas ............................................................................................... 40 3.2.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando el Péptido Diseñado ............... 42 3.2.4 Evaluación de la Capacidad de Detección de E. coli O157:H7 del Biosensor Electroquímico Utilizando los Péptidos Diseñados............................................................... 47 3.3 Resultados ........................................................................................................................ 49 3.3.1 Diseño de Péptidos Análogos a la Proteína TIR de E. coli O157:H7 Mediante Herramientas Bioinformáticas ............................................................................................... 49 3.3.2 Docking Molecular entre la Proteína Intimina y el Péptido Diseñado ......................... 53 3.3.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando el Péptido Diseñado ............... 56 3.3.4 Evaluación de la Capacidad de Detección de E. Coli O157:H7 del Biosensor Electroquímico Utilizando los Péptidos Diseñados............................................................... 61 3.4 Conclusiones Parciales .................................................................................................... 69 5. Nueva Molécula de Reconocimiento Diseñada a Partir de Peptir 1.0 para la Detección de E. Coli O157: H7 en Matrices Acuosas Mediante Biosensores Electroquímicos ............................. 70 5.1 Resumen .......................................................................................................................... 70 5.2 Metodología ..................................................................................................................... 72 5.2.1 Reactivos, Materiales e Instrumentos ........................................................................... 72 5.2.2 Modelado de Secuencias Análogas a la Molécula Peptir 1.0 ....................................... 72 5.2.3 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando AuNPs y la Molécula de Reconocimiento Peptir 2.0 .................................................................................................... 74 5.2.4 Evaluación de la Capacidad de Detección del Biosensor Electroquímico Utilizando Peptir 2.0 como Molécula de Reconocimiento ...................................................................... 74 5.3 Resultados ........................................................................................................................ 75 5.3.1 Modelado de Secuencias Análogas a la Molécula Peptir 1.0 ....................................... 75 5.3.2 Preparación del Biosensor Electroquímico Utilizando AuNPs y la Molécula de Reconocimiento Peptir 2.0 .................................................................................................... 79 5.3.3 Evaluación de la Capacidad de Detección del Biosensor Electroquímico Utilizando Peptir 2.0 como Molécula de Reconocimiento ...................................................................... 82 5.4 Conclusiones Parciales .................................................................................................... 87 6. Conclusiones Generales ............................................................................................................ 89 7. Recomendaciones ..................................................................................................................... 91 Referencias Bibliográficas ............................................................................................................ 93 Apéndice ..................................................................................................................................... 105