Estudio de genes con influencia en prolificidad y estacionalidad reproductiva en la raza ovina Rasa Aragonesa

El presente trabajo de Tesis Doctoral ha sido realizado en el marco de un proyecto INIA RTA2006‐140‐C2 que lleva por título: “Factores genéticos relacionados con la prolificidad de la raza ovina Rasa Aragonesa” y los convenios de colaboración técnica que mantiene la cooperativa UPRA Oviaragón SCL con el CITA, ATPSYRA perteneciente al Centro de Transferencia Agraria (CTA), el apoyo financiero de CDTI, PROFIT y del Programa de investigación INIA El programa de mejora genética de Carnes Oviaragón SCL cuenta con el apoyo financiero del Gobierno de Aragón y del Ministerio de Agricultura a través del Libro Genealógico de la raza Rasa Aragonesa (RAA).

La presente Tesis se centra en la caracterización y evaluación de los cuatro genes candidatos BMPR1B, BMP15, GDF9 y MTNR1A en la raza ovina Rasa Aragonesa (RAA) para ser utilizados como marcadores moleculares en la selección de reproductores dentro del esquema de mejora genética llevado a cabo por la cooperativa UPRA Oviaragón SCL. De estos, los tres primeros han demostrado tener una influencia clara sobre el carácter prolificidad en otras razas ovinas, mientras que MTNR1A se ha presentado como marcador interesante en la selección de caracteres relacionados con estacionalidad reproductiva. El resultado más destacable ha sido el aislamiento y caracterización de una nueva variante natural del gen BMP15 en RAA, denominada FecX R, que produce un promedio de 0.32 corderos más por parto en aquellas hembras portadoras del nuevo alelo en heterocigosis, mientras que las hembras portadoras en homocigosis son estériles por tener órganos sexuales inmaduros. El estudio de asociación mediante genotipado selectivo evidenció una asociación altamente significativa (P<0.001) entre la presencia del alelo FecX R en heterocigosis y valores genéticos estimados (VGEs) de prolificidad elevados en un grupo selecto de hembras del programa, confirmando la importancia directa del gen BMP15 en la prolificidad de esta raza. Molecularmente, el alelo FecX R se caracteriza por la presencia de una deleción de 17 pares de bases en la secuencia nucleotídica del segundo exón, en la región de preproteína, que produce un cambio en la pauta de lectura e introduce un codón "STOP" prematuro, impidiendo así la síntesis completa de la preproteína. El particular modo de herencia ligado al sexo, los estudios sobre el tipo de parto y freemartinismo o los estudios sobre frecuencias génicas y genotípicas llevados a cabo en la población han contribuido a valorar el estado actual de la mutación en las ganaderías aportando la información necesaria para la reestructuración del programa de cruzamientos e IA de interés para la cooperativa. El resto de genes caracterizados (BMPR1B, GDF9 y MNTR1A) no tienen efecto sobre la prolificidad en RAA. Los marcadores silenciosos de tipo SNP 606 y 612 del gen MNTR1A que en algunas razas ganaderas se han considerado asociados a estacionalidad reproductiva también están presentes en RAA. La mutación 606, resultó más relevante en esta raza por presentar asociación con ciclicidad reproductiva fuera de estación en un diseño familiar hija, indicando que el SNP606 está en desequilibrio de ligamiento con una mutación responsable cercana al gen MTNR1A, ya que otras mutaciones localizadas tanto en su zona codificante como en su promotor, no parecen presentar asociación significativa con el carácter estacionalidad.

La present Tesi es centra en la caracterització y avaluació dels cuatre gens candidats BMPR1B, BMP15, GDF9 i MTNR1A, a la raça ovina Rasa Aragonesa (RAA) per ser utilitzats en selecció assistida per marcadors (MAS) en el decurs del programa de millora genètica dut a terme per la cooperativa UPRA Oviaragón SCL. El tres primers gens han demostrat tenir influencia sobre el caràcter prolificitat en altres races ovines, mentres que l’últim sembla estar associat a estacionalitat reproductiva. El resultat més rellevant ha estat la troballa d’una nova variant gènica natural en el gen BMP15, anomenada FecX R què, en heterozigosi, produeix un increment promig de 0.32 xais més per part. Contràriament, les famelles portadores homozigótiques són estèrils per infantilisme gonadal. L'estudi de lligament per mitjà de genotipat selectiu, evidencià una associació altament significativa (P<0.001) entre presència de l’al∙lel FecX R en heterozigosi i alts valors genètics estimats (VGEs) per al caràcter prolificitat en un grup selecte de femelles del programa, que a més pertanyien a la cua alta de la distribució de valors per a aquest caràcter. Molecularment, el nou al∙lel es caracteritza per la presència d'una deleció de 17 parells de bases localitzada a la regió preproteïna de l'exó 2 del gen BMP15. Aqueta produeix un canvi en la pauta de lectura i, introdueix posteriorment un codó "stop" prematur impedint la síntesi completa de la preproteïna. Els estudis sobre freqüències gèniques i genotípiques duts a terme a la població de RAA en selecció, han servit per veure l'estat actual de la mutació en les ramaderies i per aportar la informació necessària en la reestructuració del programa d'encreuaments i IAs. A més, els estudis sobre el tipus de part i l'efecte freemartin ofereixen noves dades per a la presa de decisions en la futura selecció per prolificitat deguda al al∙lel FecX R i la seva particular modèl d'herència lligat al sexe. La resta de gens caracteritzats no apareixen associats a prolificitat en RAA. Els SNPs silents 606 i 612 del gen MNTR1A que en algunes races està associat a estacionalitat reproductiva, també són presents en la raça RAA. La mutació 606 és més rellevant que la 612 degut a que l’hem associat significativament a ciclicitat reproductiva a contra estació, en un diseny familiar filla, indicant que el polimorfisme 606 es troba en desequilibri de lligament amb una altra mutació propera al gen MNTR1A, doncs altres mutacions detectades tant a la regió codant del gen com a al seu promotor no han presentat associació amb el caràcter ciclicitat fòra de l’estació reproductiva.

This Thesis focuses on the characterization and evaluation of four candidate genes (BMP15, GDF9, BMPR1B and MTNR1A) related to prolificacy and reproductive seasonality traits in the Rasa Aragonesa (RAA) sheep breed. BMP15, GDF9 and BMPR1B have shown influence on prolificacy in other breeds while MTNR1A can influence reproductive seasonality. The most relevant result was the discovery of a new naturally occurring mutation in the BMP15 gene in the ovine Rasa Aragonesa breed. This mutation is a deletion of 17 base pairs that leads to an altered amino‐acid sequence which introduces a premature stop codon in the protein. Highly significant associations (p < 0.0001) were found between high and low estimated breeding values (EBVs) for prolificacy and the genotypes (XR/ X+) of the BMP15 gene in RAA animals. As with other mutations found in BMP15 gene, this one is associated with both increased prolificacy and sterility in heterozygous and homozygous ewes, respectively. Furthermore, statistical analysis showed that the FecXR allele increases prolificacy by 0.3243+0.0448 lambs per sheep per parturition. An accurate, reliable and quick method was developed by duplex PCR for genetic sex determination and freemartin detection, amplifying the ovine‐specific Y chromosome repetitive fragment and FecX alleles of BMP15 gene in replacement ewes. This is important as it will decrease the number of infertile ewes with non‐functioning ovaries sterilized in the womb by hormones from a male twin. New mutations discovered in the GDF9, BMPR1B and MTNR1A genes have not been shown to influence prolificacy in the RAA as they do in other sheep breeds. However, a significant effect was found between SNP606 of the MTNR1A gene and spontaneous ovulation out of the reproductive season. The T allele was associated with cyclicity in Rasa Aragonesa sheep while in other breeds, this was the C allele. This finding, along with the fact that this polymorphism does not result in an amino‐acid substitution, suggest that SNP606 may act in linkage equilibrium with a mutation in other genes responsible for breeding out of season. In this sense, new polymorphims in the promotor and coding region of the gene MTNR1A did not show any association for breeding out of season in the RAA breed.